1、傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）一步法 RT-PCR檢測試劑盒簡介 
貨號：HB-705-2 
為了適應傳染性鮭魚貧血病（ISA）快速檢測和疫病研究的需要，本公司嚴格依據(jù) 2014 版
OIE 水生動物疫病診斷手冊規(guī)定的 ISAV 的 RT-PCR 檢測病毒的引物序列及其循環(huán)參數(shù)等技術(shù)標
準，在本公司嚴謹?shù)漠a(chǎn)品質(zhì)量保證體系管控下生產(chǎn)和質(zhì)檢。確保本試劑盒滿足 OIE 中 ISAV 的檢
測標準要求。本試劑盒具有快速靈敏、特異、準確、安全、操作簡單、應用廣泛等特點及優(yōu)點。
2、試劑盒組成 
試劑盒組成包括核酸擴增試劑。具體組成參見表 1：
表 1：試劑盒組成（50test/盒）
試劑盒組成成分 體積 
*： 核酸裂解液 15ml×2 管
核酸擴增試劑： DEPC 水
ISAV RT-PCR 反應液
酶混合物
陰性對照
ISAV 陽性對照
1ml×1 管
750µL×1 管
60µL×1 管
1ml×1 管
1ml×1 管
（注：*可使用本公司生產(chǎn)的提取核酸更快捷方便的《病毒 RNA 柱式提取試劑盒》） 
3、樣本采集,存放及運輸 
3.1 樣本采集：所用取樣器材必須經(jīng)高壓滅菌并烘干。
取新鮮魚類組織臟器（肝、腦、脾、腎）2g 于已洗凈、滅菌并烘干的研缽中充分研磨，加 5ml PBS混勻，2 000r/min 離心 10min 取上清轉(zhuǎn)入無菌離心管中備用?；蛉∮锌梢杉毎∽兊募毎麘乙河糜跈z測。
3.2 存放：研磨后的樣本在 2 ℃—8 ℃條件下保存應不超過 24 h；-70 ℃以下可*保存，但應避免反復凍融（zui多凍融 3 次）。
3.3 運輸：采用泡沫箱加冰密封進行運輸。
4、一步法 RT-PCR 檢測 
4.1 樣本的處理（在樣本制備區(qū)進行）： 
4.1.1 取n個滅菌的1.5 mL Eppendorf管，其中n為被檢樣品與陰性對照的和（陽性對照、陰性對照在試劑盒中已標出），做標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為一步法RT-PCR檢測的模板，無需提取核酸)4.1.2 每管加入 600 µL 裂解液，分別加入被檢樣本和陰性對照各 200 µL，一份樣本換用一個吸頭，混勻器上振蕩混勻 5 s（不能過于強烈，以免產(chǎn)生乳化層，也可以用手顛倒混勻），于 4℃ 12 000 r/min 離心 15 min。
4.1.3 取與 4.1.1.1 相同數(shù)量滅菌的 1.5 mL Eppendorf 管，加入 500 µL 異丙醇（-20℃預冷），做標記。吸取 4.1.1.2 各管中的上清液轉(zhuǎn)移至相應的管中，上清液應至少吸取 500µL，不能吸出
中間層，顛倒混勻。
4.1.4 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 15 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小心倒去上清，倒置于吸水紙上，沾干液體(不同樣品須在吸水紙不同地方沾干)；加入 600 µL 75％
乙醇，顛倒洗滌。
4.1.5 于 4 ℃、12 000 r/min 離心 10 min（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），小心
倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量沾干液體（不同樣品須在吸水紙不同地方沾干）。
4.1.6 4 000 r/min 離心 10s（Eppendorf 管開口保持朝離心機轉(zhuǎn)軸方向放置），將管壁上的殘余液體甩到管底部，小心倒去上清，用微量加樣器將其吸干，一份樣本換用一個吸頭，吸頭不要碰
到有沉淀一面，室溫干燥 3 min，不能過于干燥，以免 RNA 不溶。
4.1.7 加入 11 µL 或 21 µL DEPC 水，輕輕混勻，溶解管壁上的 RNA，2 000 r/min 離心 5 s，冰上保存?zhèn)溆?。提取?RNA 須在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增; 若需*保存須放置-70 o
C 冰箱?！疽部蓞⒄铡恫《?RNA 柱式提取試劑盒說明書》（貨號：HB-QPCR-01）使用，更方便快捷取核酸】。
4.2、傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）一步法 RT-PCR檢測試劑盒試劑準備 
4.2.1 擴增試劑準備（在反應混合物配制區(qū)進行）：
從試劑盒中取出相應的一步法RT-PCR反應液、RT-PCR混合酶，在室溫下融化后，2 000 r/min
離心5 s。設所需一步法RT-PCR檢測總數(shù)為n，其中n為被檢樣品、陽性對照與陰性對照的和，每個樣
品測試反應體系配制見下表2。
表 2 每個樣品測試反應體系配制表
試劑 RT-PCR 反應液 RT-PCR 混合酶
用量 15 μL 1.0 μL
根據(jù)測試樣品的數(shù)量計算好各試劑的使用量，加入到適當體積試管中，充分混合均勻，向每個
一步法RT-PCR管中各分裝15 μL，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
4.2.2 加樣（在樣本處理區(qū)進行）：
在各設定的一步法RT-PCR管中分別加入上述樣本處理步驟4.1.1.7中制備的RNA溶液各10μL，蓋
緊管蓋，500 r/min離心30s。
注：試劑盒中的陽性對照直接作為一步法RT-PCR檢測的模板，無需提取核酸。 
4.3、檢測（在檢測區(qū)進行）： 
將4.2.2中離心后的PCR管放入PCR檢測儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。循環(huán)條件設置如下：
*階段：42 oC/30 min；
第二階段：95 oC/3 min；
第三階段：95 oC/45 sec, 54 oC/1 min，72 oC/1 min, 35個循環(huán)；
第四階段，72 oC/10 min；
第五階段，4 oC 保存。 
4.4、瓊脂糖電泳 
用電泳緩沖液制備1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠面。將10μL樣品PCR擴增產(chǎn)物和相應電泳上樣緩沖液（Loading Buffer）按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設立DNA標準分子量作對照。5 V/cm電泳約0.5 h，當溴酚藍到達底部時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增初預期的特異性DNA電泳帶，拍攝并記錄。
5、結(jié)果判定 
5.1 ISA一步法RT-PCR后陽性對照出現(xiàn)一條304 bp的DNA片段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。
5.2 待測樣品在相應 304 bp DNA 位置上有帶，可判陽性。無帶或帶的大小不是 304bp 的判為陰性。
6、傳染性鮭魚貧血病毒（ISAV）一步法 RT-PCR檢測試劑盒相關(guān)技術(shù)信息 
引物序列
ISAV F：5’-GAC-CAG-ACA-AGC-TTA-GGT-AAC-ACA-GA-3’
ISAV R：5’-GAT-GGT-GGA-ATT-CTA-CCT-CTA-GAC-TTG-TA-3’