ELISA試劑盒檢測(cè)流行性腹瀉病毒抗體的方法說(shuō)明

一、ELISA試劑盒準(zhǔn)備材料
（1） 聚苯乙烯塑料微量組織培養(yǎng)板：4×10孔，。
（2） 包被液（pH值96）：NaHCO3 293g、Na2CO3 195g，蒸餾水加至1 000ml，置4℃保存。
（3） 洗滌液（001mol/L、pH值74PBS）：NaCl 80g、KH2PO402g、Na2HPO4•12 H2O 29g、KCl 02g、Tween20 05ml，加蒸餾水至1000ml。
（4） 保溫液：牛血清白蛋白（BSA） 01g、005% PBSTween20 100ml，4℃保存。
（5） 底物溶液（OPDH2O2）
磷酸鹽檸檬酸緩沖液（pH值50）：02mol/L Na2HPO4（284g/L）257ml、01mol/L檸檬酸（192g/L）243ml、蒸餾水50ml。
底物溶液：磷酸鹽檸檬酸緩沖液100ml、鄰苯二胺（OPD）40mg、30%H2O2 015ml，現(xiàn)配現(xiàn)用。
（6） 終止液（2mol/L H2SO4）：濃硫酸222ml、蒸餾水1778ml。
（7） 豬流行性腹瀉（PED）抗原：PEDV豬胎腸原代細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融，65℃ 30min滅活。zui后以3 000 r/min離心30min，取上清分裝，-20℃保存?zhèn)溆??？乖牡鞍诐舛葹?00μg/ml。
（8） 酶標(biāo)兔抗豬抗體結(jié)合物：按郭春祥方法制備。mol/L比為196，酶結(jié)合物效價(jià)為1∶10 000。
（9） 被檢豬血清：采自疫區(qū)豬和病豬。PEDV免疫豬血清及健豬血清分別用于陽(yáng)性、陰性對(duì)照。
二、ELISA試劑盒操作程序
（1） 抗原包被：用包被液將PEDV抗原作1∶5稀釋包被反應(yīng)板，每孔100μl，同時(shí)設(shè)陰性細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)照孔，置4℃過(guò)夜。
（2） 洗滌：用洗滌液洗滌2次，每次2min，瀝干。
（3） 加入被檢血清：用保溫液將被檢血清作1∶100稀釋，加入反應(yīng)板相鄰的兩個(gè)孔中，每孔100μl。同時(shí)作陰、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照，置37℃孵育1h。
（4） 洗滌3次：方法同上。
（5） 加入酶結(jié)合物：用保溫液將酶結(jié)合物作1∶4 000稀釋，加入反應(yīng)孔中，每孔100μl，置37℃孵育1h。
（6） 洗滌3次：方法同上。
（7） 加入底物：每孔100μl，置室溫暗盒內(nèi)顯色20min。
（8） 加入終止液：每孔50μl，靜置5min。
（9） 測(cè)定OD值：用檢測(cè)儀，于492nm波長(zhǎng)，按儀器使用及制定標(biāo)準(zhǔn)要求調(diào)節(jié)儀器，測(cè)定各反應(yīng)孔的OD值，記錄結(jié)果。
結(jié)果判定凡檢測(cè)血清P/N值超過(guò)14的，均判為陽(yáng)性。肉眼觀察，凡反應(yīng)孔的顏色比正常細(xì)胞對(duì)照孔、正常血清對(duì)照孔顏色深者為陽(yáng)性。
三、注意事項(xiàng)
1、各種常用的酶標(biāo)反應(yīng)比色計(jì)性能不一，測(cè)定時(shí)需根據(jù)各自的儀器確定閾值。
2、在各載體中使用zui多的為聚苯乙烯塑料板。不同廠牌，甚至不同批號(hào)的反應(yīng)板吸附性能往往有很大差異，因此使用前需要加以選擇。方法為：在整塊板上測(cè)定同一標(biāo)本，求出每一對(duì)孔的平均OD值，將此值與該板的總均值相比，其差值需在±10%以內(nèi)。
3、由于反應(yīng)板可能存在邊緣效應(yīng)，因此測(cè)定標(biāo)本時(shí)至少要取兩孔的平均值。
4、如非特異性吸附較強(qiáng)，需考慮采用封閉等方法排除。（1） 封閉：可選用4%～10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%馬血清、01%～25%明膠等。
（2） 去污劑：可阻止非特異吸附，而不影響特異性抗原抗體反應(yīng)。常用的有005%～05%吐溫20、吐溫80、01%NP40等。
（3） 高鹽濃度緩沖液：如含05mol/L NaCl及005%吐溫的磷酸鹽緩沖液（pH值80）。
（4） 縮短孵育時(shí)間：保溫液中加入終濃度4%的聚乙二醇（PEG，MW6 000）可縮短抗原抗體反應(yīng)的孵育時(shí)間（20min以內(nèi)）。
5、為了增加聚苯乙烯板對(duì)某些抗原或抗體的吸附作用，可試用鞣酸處理，牛血清白蛋白處理，改變載體的表面電荷，引入ELISA試劑盒等方法處理反應(yīng)板。