植物脫落酸（ABA）ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)分析
試驗(yàn)原理：
植物脫落酸ABA試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知ABA濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將ABA和*標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中ABA的濃度呈比例關(guān)系。
試劑盒內(nèi)容及其配制
試劑盒成份（2-8℃保存） | 96孔配置 | 48孔配置 | 配制 |
96/48人份酶標(biāo)板 | 1塊板（96T） | 半塊板（48T） | 即用型 |
塑料膜板蓋 | 1塊 | 半塊 | 即用型 |
標(biāo)準(zhǔn)品：80pmol/L | 1瓶（0.6ml） | 1瓶（0.3ml） | 按說明書進(jìn)行稀稀 |
空白對(duì)照 | 1瓶（1.0ml） | 1瓶（0.5ml） | 即用型 |
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液 | 1瓶（4.0ml） | 1瓶（2.0ml） | 即用型 |
*標(biāo)記的抗ABA抗體 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
親和鏈酶素-HRP | 1瓶（8.0ml） | 1瓶（4.0ml） | 即用型 |
洗滌緩沖液 | 1瓶（20ml） | 1瓶（10ml） | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
底物A | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
底物B | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
終止液 | 1瓶（6.0ml） | 1瓶（3.0ml） | 即用型 |
標(biāo)本稀釋液 | 1瓶（12ml） | 1瓶（6.0ml） | 即用型 |
植物脫落酸ABA自備材料
1． 蒸餾水。
2． 加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3． 振蕩器及磁力攪拌器等。
安全性
1． 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請(qǐng)盡快用水沖洗。
2． 實(shí)驗(yàn)中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
3． 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。
操作注意事項(xiàng)
1． 植物脫落酸ABA試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。
2． 實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
3． 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號(hào)的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
4． 使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。
5． 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
6． 洗滌酶標(biāo)板時(shí)應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
7． 底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時(shí)間打開蓋子。底物B對(duì)光敏感，避免長時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。
8． 加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。
9． 按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
試劑的準(zhǔn)備
1． 標(biāo)準(zhǔn)品：植物脫落酸ABA標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時(shí)準(zhǔn)備，不能儲(chǔ)存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：
80 pmol/L | （6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
40 pmol/L | （5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
20 pmol/L | （4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的5號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
10 pmol/L | （3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的4號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
5.0 pmol/L | （2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的3號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
2.5 pmol/L | （1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品） | 100ul的2號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 |
0 pmol/L | （空白對(duì)照） | 原始濃度不用稀釋直接加入50ul。 |
2． 洗滌緩沖液（50×）的稀釋：蒸餾水50倍稀釋。
操作步驟
1． 使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。
2． 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。標(biāo)本用標(biāo)本稀釋液1：1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。
3． 植物脫落酸ABA加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的*標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育1小時(shí)。
4． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
5． 每孔加入60ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。
6． 甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。
7． 每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育10分鐘。避免光照。
8． 取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
9． 在450nm波長處測定各孔的OD值。
建議使用的實(shí)驗(yàn)方案
| 標(biāo)準(zhǔn)品濃度（pmol/L） | |
A | 80 | 80 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
B | 40 | 40 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
C | 20 | 20 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
D | 10 | 10 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
E | 5.0 | 5.0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
F | 2.5 | 2.5 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
G | 0 | 0 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
H | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 | 樣品 |
局限
6號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。
植物脫落酸ABA試劑盒性能
1. 靈敏度：zui小的檢測濃度小于1號(hào)標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
2. 特異性：不與其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。
結(jié)果判斷與分析
1、儀器值：于波長450nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值
2、以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的ABA標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的ABA含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
3、檢測值范圍：0-80pmol/L
4、敏感度： 0.1 pmol/L
