人乳酸脫氫酶（D-LDH）ELISA試劑盒檢測原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被人乳酸脫氫酶（D-LDH）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人乳酸脫氫酶（D-LDH）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

樣品收集、處理及保存方法

1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。

2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

人乳酸脫氫酶（D-LDH）ELISA試劑盒自備物品
酶標儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱

操作注意事項
  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
  實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
  預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取50μL加樣即可。
  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
  所有液體組分使用前充分搖勻。

試劑的準備

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板方法
  手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
  自動洗板機：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

人乳酸脫氫酶（D-LDH）ELISA試劑盒操作步驟
  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  設(shè)置標準品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
  待測樣本孔各加待測樣本50μL；
  隨后標準品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
  所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
  所有孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。