1. Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)

2. Eppendorf Perfect RNA Eukaryotic試劑盒

3. 所有的PCR反應(yīng)均在Eppendorf Mastercycler-gradient梯度PCR儀上進(jìn)行。

擴(kuò)增目標(biāo)：500 bp 的人α微管蛋白mRNA 片段。

模板RNA：從人HELA細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度從1μg遞減至10pg。

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR系統(tǒng)，標(biāo)準(zhǔn)一步法RT－PCR方案。1:10 稀釋RTplusPCR 緩沖液，鎂離子終濃度2.5 mM，反應(yīng)總體積50μl

cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)顯示出一種依賴于模板RNA 量的寬廣的產(chǎn)物產(chǎn)量動力學(xué)范圍。能從低至10 pg 的HELA 總RNA中檢測到α微管蛋白mRNA。

擴(kuò)增目標(biāo)：5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子(hTSF)mRNA 片段。

模板RNA：從人HELA 細(xì)胞中純化的總RNA。反應(yīng)中應(yīng)用的模板濃度為100 ng 和10 ng。

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，針對長模板的特殊RT－PCR 方案。

應(yīng)用一步法RT－PCR 方法，可以從100 ng 和10 ng 總RNA 中檢測到5.3 kb 的hTSF PCR 產(chǎn)物。這個PCR 反應(yīng)非常困難，大多數(shù)RT－PCR 試劑盒生產(chǎn)廠家從未發(fā)布過應(yīng)用一步法方案，有效擴(kuò)增類似長度模板的結(jié)果。相反，Eppendorf 試劑盒能穩(wěn)定可靠地從10 ng HELA 細(xì)胞RNA 中擴(kuò)增該產(chǎn)物。

兩步法RT－PCR 的擴(kuò)增目標(biāo)：

500 bp 的(鼠和人)α微管蛋白mRNA 片段

1.3kb 的(鼠和人)腫瘤壞死因子受體(TNFR1)mRNA 片段

5.3 kb 的人結(jié)節(jié)性腦硬化因子(hTSF)mRNA 片段

12.3 kb 的鼠動力蛋白mRNA 片段

方案：Eppendorf cMaster RTplusPCR 試劑盒，采用產(chǎn)品說明書中的針對普通長度模板和較長模板的兩步法RT－PCR 程序。所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)均采用0.5μg 的Oligo(dT)20 引物為引物。

注：動力蛋白的逆轉(zhuǎn)錄孵育時間延長至90 分鐘。

* -- 微管蛋白

** -- TNFR1

對5 種不同表達(dá)水平的基因進(jìn)行RT－PCR。為了得到zui高的靈敏度，RT 和PCR 反應(yīng)分開進(jìn)行。如圖3 所示，對于α微管蛋白和TNFR1，我們可以應(yīng)用兩步法RT－PCR 方法并將退火和延伸步驟合并為進(jìn)行一次68℃ 孵育。如圖3 所示，無論片段長度大小和拷貝數(shù)高低，所有反應(yīng)都可以順利進(jìn)行。即使對于動力蛋白這種特別長(達(dá)12.3 kb)的稀有轉(zhuǎn)錄本，用cMaster RTplusPCR 系統(tǒng)也能夠進(jìn)行有效擴(kuò)增，而且結(jié)果具有的重復(fù)性，表明即使對于困難的RT－PCR 反應(yīng)， Eppendorf 試劑盒也能獲得可靠結(jié)果。

cMaster RT 系統(tǒng)是為了給所有的RT 和RT－PCR 應(yīng)用提供zui大的靈活性而設(shè)計(jì)的。該試劑盒結(jié)合了重組的同二聚體病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和*的RTplusPCR 反應(yīng)緩沖液系統(tǒng)，可以在較寬的溫度范圍(37℃－60℃)和0.2kb-12.5kb產(chǎn)物大小范圍內(nèi)進(jìn)行有效的cDNA 合成。cMaster RTplusPCR 酶混合物兼具熱穩(wěn)定性DNA 聚合酶活性，校正功能輔助的保真性和高延伸效率。應(yīng)用于一步法中，可以靈敏地檢測到極少量的總RNA 并擴(kuò)增出長達(dá)5.3 kb的cDNA。兩步法方案可以從RT 反應(yīng)中擴(kuò)增多個目的cDNA，PCR產(chǎn)物的片段長度可增加至12.3 kb。 其他的擴(kuò)展應(yīng)用：系統(tǒng)的逆轉(zhuǎn)錄部分即cMaster RT 可以與任何PCR系統(tǒng)合用或者為其他下游應(yīng)用如雜交實(shí)驗(yàn)合成cDNA 探針。