198．蘇州華宇牌超凈工作臺在茶多酚影響乳腺癌組織C-Jun 蛋白表達研究中的應(yīng)用發(fā)展

1 材料

1.1 動物與細胞系：雌性BALB/c 小鼠60 只，體重（20±2）g，購自上海斯克萊實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（滬）2003-0003]，并在南京中醫(yī)藥大學(xué)動物中心屏障系統(tǒng)SPF 環(huán)境下飼養(yǎng)。EMT6 小鼠乳腺癌細胞購自*第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。

1.2 藥物：茶多酚購自浙江東方茶業(yè)有限公司，純度98％（批號：20050334）；人參皂苷Rg3（參一膠囊）每粒含人參皂苷Rg3 10 mg，購自吉林亞泰有限公司（批號：20040704）。
1.3 儀器：超凈工作臺系蘇州市華宇凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)（型號sa-cj-2FD）；離心機由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)（型號KA-1000）；萊卡倒置顯微鏡為德國萊卡公司產(chǎn)品（型號 DMIL）；Forma 恒溫培養(yǎng)箱為美國Forma 公司產(chǎn)品（型號3111）。

1.4 試劑：c-jun Oncoprotein 抗體由美國CASTRATM 公司提供（批號：105205）；免疫組化超敏鼠組織試劑盒（UltraSensitiveTMS-P）購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)與接種：EMT6 細胞用含10％ 小牛血清的RMPI1640 培養(yǎng)液培養(yǎng)，細胞長滿單層后用0.25％胰酶消化，培養(yǎng)液吹打離心，收集細胞用PBS 稀釋，濃度調(diào)至5×106，每只小鼠以0.2 ml 接種于小鼠右后背部。12 天后腫瘤長至1g 時移植。

2.2 腫瘤移植：斷頸處死荷瘤小鼠，75％酒精浸泡3～5min 后放于超凈工作臺平皿中，用高壓滅菌的手術(shù)器械剪開腫瘤皮膚，分離腫瘤包膜，取出腫瘤以消毒后的PBS 清洗，稱重，按每克腫瘤4ml 溶液的比例用生理鹽水稀釋。剪碎瘤體，充分勻漿制成細胞懸液，濃度調(diào)至2×106，每只小鼠于右后背部皮下接種0.2ml。

2.3 分組及用藥：接種第13 天腫瘤長至1mm3 時（成瘤48 只），隨機分為4 組，即茶多酚灌胃組、茶多酚局部注射組、人參皂苷Rg3 灌胃組，模型對照組。每組12 只動物。所有給藥劑量均采用人與動物劑量換算法確定。即：①茶多酚灌胃組：按人治療量900mg/d 計算，換算成實驗用藥中劑量為11.25mg/kg，并按小鼠體重20g 計算，以2.25mg/d 配置濃度5.625mg/ml，每天灌胃0.4ml。②茶多酚局部注射組：參考茶多酚腹腔注射LD50 160mg/kg劑量，取其1/4 量為實驗用小劑量組，換算成實驗用藥中劑量為12mg/kg，以2.4mg/d 配制濃度24mg/ml，每天局部注射0.1ml。③人參皂苷Rg3 組：按人治療腫瘤劑量40mg/d 計算，換算成20g 小鼠劑量為0.1mg/d，配制濃度為0.25mg/ml，每天灌胃0.4ml。④模型對照組：生理鹽水灌胃，每天0.4ml。在接種第13 天開始給藥、給水，每日1 次，連續(xù)給藥10 天。第11 天處死小鼠，取腫瘤組織制備切片待撿。

2.4 原癌基因蛋白C-Jun 檢測：將腫瘤組織取出后迅速放置于10%福爾馬林溶液中固定，第二天脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片為4um 厚，其中取一張做HE 染色，其余每組選取3 個組

織切片，按相關(guān)試劑盒說明檢測C-Jun 表達。用PBS 作為一抗做陰性對照。各組選取腫瘤組織3 個組織切片，每片選3 個視野，用美國TN-8502 圖像分析系統(tǒng)作圖像分析，測定光

密度（IOD）值，取其平均值，以均數(shù)±標準差（x ± s）表示。

2.5 統(tǒng)計方法：實驗數(shù)據(jù)用SPSS11.5 計算機統(tǒng)計軟件進行t 檢驗，當P<0.05 時表示差異有顯著性，當P>0.05 時表示無統(tǒng)計意義。