1.1

藍靛果

 [Lonicera edulis Turcz.]別名藍靛果忍冬、藍果忍冬、藍果，俗稱山茄子、羊奶子、黑瞎子果，為忍冬科忍冬屬多年生落葉小灌木，果實為藍色小漿果，具有很高的食用與保健價值。

1.2

植物組織培養(yǎng)

在無菌條件下，將離體的植物器官、組織、細胞或原生質(zhì)體等，培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基和人工控制的環(huán)境中，使其再生新植株的過程和技術(shù)。（GB/T 16620）

1.3

外植體

用于植物組織培養(yǎng)的離體植物器官、組織、細胞以及原生質(zhì)體等。

1.4

培養(yǎng)基

根據(jù)植物營養(yǎng)原理與植物組織培養(yǎng)的要求人工配制的營養(yǎng)基質(zhì)。

1.5

培養(yǎng)基母液

按試劑種類和性質(zhì)分別配制的高于培養(yǎng)基配方濃度的溶液。

1.6

植物生長物質(zhì)

調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)，包括植物激素和植物生長調(diào)節(jié)劑。常用的植物生長物質(zhì)有生長素類似物IBA（吲哚丁酸）、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）、NAA（萘乙酸）、KT（激動素）等。

1.7

外植體滅菌

將外植體表面的微生物*殺死并盡可能少傷害外植體組織和表層細胞的過程。

1.8

接種

將滅菌后的外植體在無菌條件下接入培養(yǎng)容器內(nèi)的培養(yǎng)基中的過程。

1.9

誘導培養(yǎng)

將滅菌后的外植體接種到誘導愈傷組織等器官培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的過程。

1.10

繼代培養(yǎng)

培養(yǎng)過程中將培養(yǎng)材料周期性地分株、分割等操作后，轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)的過程。

1.11

生根培養(yǎng)

將不定芽轉(zhuǎn)移到生根誘導培養(yǎng)基中誘導生根，生成完整植株的過程。

1.12

移栽

組培苗在培養(yǎng)瓶中長出一定數(shù)量的根或根原基后，從瓶中取出移植到基質(zhì)中的過程。

2　實驗設備

2.1

滅菌設備

高壓蒸汽滅菌鍋、紫外燈。

2.2

接種設備

超凈工作臺、槍式鑷子、眼科用解剖剪、*、酒精燈等。

2.3

培養(yǎng)設備

培養(yǎng)容器瓶（罐頭瓶）、培養(yǎng)架、空調(diào)、照明燈管。

2.4

實驗設備

電子天平（0.01mg）、冰箱、pH 5.0～7.0精密試紙、酸度計、溫濕度表、照度計、燒杯、試劑瓶、量筒、容量瓶、移液槍等。

3　環(huán)境設備消毒滅菌

3.1

接種室消毒滅菌

接種前用紫外燈照射30min，每周用*及甲醛混合薰蒸。

3.2

培養(yǎng)室消毒滅菌

每周用*及甲醛混合薰蒸。 

3.3

超凈工作臺的消毒滅菌

接種前用紫外燈照射30min，并用70％酒精擦拭臺面，定期清洗超凈工作臺過濾膜。

3.4

接種器具的消毒滅菌

使用前將槍式鑷子、解剖剪、培養(yǎng)皿、*進行高溫蒸汽消毒；接種過程中采用酒精燈灼燒消毒。

4　組培育苗

4.1

培養(yǎng)基制備

4.1.1

母液配制及保存

選用化學純或分析純的化學藥品，根據(jù)MS培養(yǎng)基配方，分別配制大量元素（50倍）、微量元素（100倍）、鐵鹽（200倍）、有機物（100倍）、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（0.1～0.5mg/mL）幾種化合物的母液（見附件A.1和附件A.2），將母液保存在4℃的冰箱里。

4.1.2

培養(yǎng)基配制

根據(jù)培養(yǎng)基配方需求，每升培養(yǎng)基中分別加入瓊脂粉（6.5g）、蔗糖（30g）和各類母液，依次溶解于蒸餾水，定容后用0.1mol/L HCl或0.1mol/L lNaOH溶液調(diào)節(jié)pH=5.8，定量分裝至培養(yǎng)瓶中并封口，制備成培養(yǎng)基，備用。培養(yǎng)基配制流程見下圖。

圖

4.2

培養(yǎng)基滅菌

瓶裝培養(yǎng)基在10h內(nèi)完成滅菌，滅菌方式采用高壓蒸汽滅菌，在壓力0.105MPa、溫度121℃條件下滅菌20min～30min。鍋內(nèi)的滅菌物以不超過鍋的容量3/4為宜，高壓滅菌時鍋內(nèi)使用蒸餾水。

4.3

培養(yǎng)基保存

滅菌后的培養(yǎng)基放入接種室，常溫條件下7d內(nèi)使用，2℃～4℃條件下14d內(nèi)使用。培養(yǎng)基應保存于潔凈環(huán)境中，注意避光和防塵。

4.4

外植體接種

4.4.1

外植體的選擇

選擇生長健康、強壯的植株作為采樣母株，剪取母樹下部的半木質(zhì)化的莖段作為外植體，采樣時間宜選擇晴天或露水干后采集。

4.4.2

外植體滅菌

先將外植體用洗滌劑作表面清洗，清除表面的塵土，再將外植體用流水沖洗30min后，將外植體放入消毒瓶中。把裝有外植體的消毒瓶放入超凈工作臺，在超凈工作臺上打開裝有外植體的消毒瓶，倒入70%酒精并搖晃消毒瓶，浸泡消毒10s，倒去酒精，用無菌水沖洗外植體3次～5次；然后用0.1% HgCl2浸泡8min，無菌水沖洗3次～5次，用無菌濾紙吸干外植體表面的水分。

4.4.3

外植體切割

將表面消毒后的外植體切割，接入培養(yǎng)基中。莖在接種前用*刀剪去兩端，長1.0 cm～2.0cm。

4.4.4

外植體接種

操作時，先將培養(yǎng)瓶的封口膜輕輕取下，放在一邊，將培養(yǎng)瓶口在酒精燈外焰上旋轉(zhuǎn)灼燒消毒，殺死瓶口的微生物。將槍式鑷子在酒精燈上灼燒消毒并冷卻后，將外植體接種到培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)瓶放3個外植體，接種后蓋上封口膜，并標注日期。

4.5

組培苗培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室的溫度控制在25℃±3℃，相對空氣濕度控制在70%～80%，光照強度為27μmol?m-2?s-1～36μmol?m-2?s-1，光照時間為12h/d。

4.5.1

誘導培養(yǎng)

將外植體接種到誘導培養(yǎng)基中，誘導培養(yǎng)基選用：MS基本培養(yǎng)基+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.2 mg/L，培養(yǎng)20d～25d后進行繼代增殖培養(yǎng)。

4.5.2

繼代增殖培養(yǎng)

外植體經(jīng)誘導培養(yǎng)生成愈傷組織或叢生芽，轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，繼代增殖培養(yǎng)基可選用：MS基本培養(yǎng)基+6-BA 0.5mg/L+IBA 0.3mg/L+KT 1.0 mg/L，培養(yǎng)30-35d。

4.5.3

生根培養(yǎng)

選取培養(yǎng)瓶中長度1.5cm～3.0cm生長健壯的芽接種至生根培養(yǎng)基中，生根培養(yǎng)基可選用：1/2MS基本培養(yǎng)基+NAA 0.5mg/L+IBA 1.0mg/L。培養(yǎng)25d～35d,組培苗生長過程中在基部會出現(xiàn)白色嫩根，25d后平均生根數(shù)3條以上，根長約在1.0cm～4.0cm。

4.6

煉苗

4.6.1

煉苗標準

當組培幼苗基部長出3條以上長1.0cm～4.0cm的新根、苗高3～8cm，即可進行煉苗處理。

4.6.2

組培苗馴化

將裝組培苗的培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)架上輕輕取下，迅速轉(zhuǎn)移到日光溫室中，自然散射光下煉苗，溫度控制在20℃～25℃，每天中午在培養(yǎng)瓶周圍噴灑霧水，以保濕降溫，封口煉苗1d～2d。

4.6.3

開瓶鍛煉

封口煉苗后打開瓶口，向瓶內(nèi)注入超過培養(yǎng)基表面0.5cm高的自來水，溫度控制在20℃～25℃，

2d～4d后即可移栽。

4.6.4

組培苗質(zhì)量與分級

按照株高高矮分級，分2級，即苗高≦5cm和﹥5cm。

4.7

移栽苗

用手指或鑷子輕輕取出組培苗，用清水洗去苗基部的培養(yǎng)基，移栽至裝有黑壤土、草碳土和細河沙（混合比例為2：1：1）的混合基質(zhì)的育苗盤中，育苗基質(zhì)中按每立方米基質(zhì)加入1kg磷酸二氫銨。育苗盤規(guī)格為35cm×50cm，育苗盤四壁高度不能低于7cm，育苗基質(zhì)放入育苗容器并澆透水后，厚度應不小于5cm。

4.8

移栽苗管理

育苗期保持育苗基質(zhì)見干見濕，育苗水分管理按照GB/T 6001進行。溫室空氣濕度應保持70%～80%，溫度應在18℃～25℃。

4.9

病蟲害管理

藍靛果苗期病害主要為立枯病。主要防治方法：育苗前使用0.05%炭疽福美作藥土防治，或50%多菌靈、70%甲基硫菌靈等作藥土防治，每平方米用藥8～9克；幼苗發(fā)病前期噴藥防治，選用70%土菌消（惡霉靈）可濕性粉1000倍液，或70%甲基硫菌靈可濕性粉劑800倍液，隔周噴施，共噴兩次。

蟲害主要是螞蟻。防治方法：應在育苗床周邊撒一圈百蟲靈等驅(qū)蟻藥。

生淀粉糖化酶一般指可以直接作用、水解或糖化未經(jīng)蒸煮的淀粉顆粒的酶，可能包括α-*、β*、葡萄糖*、普魯蘭酶。它可以將淀粉傳統(tǒng)工藝中的糊化、液化和糖化合并為一步直接進行糖化，如果將其應用于無蒸煮的酒精發(fā)酵，可節(jié)約總能耗的30%~40%。已發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)生*的微生物種類較多，報道zui多的是黑曲霉、根霉和芽孢桿菌。本文篩選出能產(chǎn)生*的細菌，對其進行初步鑒定，并進行了酶學性質(zhì)的研究。

1   材料與方法

1.1  土樣

     校內(nèi)食堂垃圾附近的土壤。

1.2  培養(yǎng)基

     平板分離培養(yǎng)基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂20g、蒸餾水1000ml，pH7.2~7.4,121℃滅菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干熱滅菌2h，然后在65℃下無菌操作加入。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、蒸餾水1000ml，pH7.2~7.4,121℃滅菌20min。其中可溶性淀粉在105℃下干熱滅菌2h，然后在常溫下無菌操作加入。

1.3 菌種篩選方法

    初篩：變色圈法，選擇圈徑比較大的菌落，進一步劃線分離后，進行產(chǎn)酶測定。

    復篩：測酶活，選擇酶活高的菌株作為目的菌株。

1.4 生*活的測定方法

    酶活力測定方法：將發(fā)酵液在4℃，8000r/min下，離心30min后取出上清液，再通過抽濾得到的濾液為粗酶液，取1ml粗酶液，加入到19mLpH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中，再加入0.5g的可溶性淀粉為底物，30℃水解2h后用0.5ml4%的NaOH溶液終止反應，反應液在4000r/min下離心5min，用DNS法測定上清液中還原糖的含量，測定540nm處的吸光度（在酶活測定體系中，以純水取代粗酶液作為空白），查葡萄糖標準曲線得到水解產(chǎn)物中的葡萄糖量，從而確定生*的酶活力大小。

酶活力定義：在pH6.5、溫度為30℃保溫120min條件下，1min產(chǎn)生1ug葡萄糖所需要的酶的量規(guī)定為1個酶活力單位（U）。

1.5 菌種鑒定

   進行形態(tài)和生理生化檢測。

1.6 生淀粉糖化酶的酶學性質(zhì)研究

1.6.1 酶的熱穩(wěn)定性研究 取一定量的粗酶液，分別在50℃、60℃、70℃和80℃不同溫度下保溫60min，每隔10min測定殘留酶活力。

1.6.3 pH的影響  配制pH分別為3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0、7.6、8.0和8.6的檸檬酸鹽緩沖液，在不同pH緩沖液中讓酶水解生淀粉，通過水解產(chǎn)物中葡萄糖的量計算酶活力的大小。

1.6.4 酶的pH穩(wěn)定性研究  將酶溶于pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中，分別放置1、2、4、6、9、12、24、36、48和60h后，測定殘余物的酶活力大小。

1.6.5 金屬離子的影響  以不加金屬離子為對照，分別在反應液中加入1mmol/L的Ca2+、Na+、Mg2+、Fe3+、K+、Mn2+、Zn2+和Cu2+，測定酶活。

2  結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選

    從初篩平板上挑出了8株有較大淀粉水解圈的菌株，分別編號為QD001到QD008。測得它們各自的圈徑比見表1，對圈徑比較大的菌株QD001、QD006和QD007做斜面保藏并通過搖瓶復篩，得到QD006酶活力zui高，達到10、18U/ml，確定為目標菌株。

2.2  菌種鑒定

     QD006的菌落較小，較薄，較透明且“細膩"，邊緣光滑，革蘭氏染色確定該菌為革蘭氏陽性菌，經(jīng)顯微觀察呈球形，為球菌；糖類發(fā)酵試驗顯示改菌能利用葡萄糖，蔗糖，但不能利用乳糖：VP試驗為陰性；MR試驗為陰性；吲哚試驗為陰性；檸檬酸鹽為陰性。初步鑒定該菌為Staphylococcus intermedius。

2.3生淀粉糖化酶的酶學性質(zhì)

2.3.1 溫度對酶活的影響

   由圖1可知，酶的zui適作用溫度為50℃。當溫度小于50℃時，反應速率隨溫度升高而升高，但高于zui適溫度，酶的反應速率下降。

2.3.2 生淀粉糖化酶的熱穩(wěn)定性

    由圖2可知，該生淀粉糖化酶在50℃和60℃時，放置1h后，殘余酶活分別是99.8%和98.2%，由此可知，在60℃內(nèi)，該生淀粉糖化酶具有很好的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 pH對酶活力的影響

    由圖3可知，該酶的zui適為6.5左右，同時可以看出pH在3-4.5的范圍內(nèi)，生淀粉糖化酶的酶活變化不大，上升趨勢比較小，但pH對生淀粉糖化酶的影響呈現(xiàn)出明顯的鐘罩形。

2.3.4 酶的耐酸穩(wěn)定性

    由圖4可知，該生淀粉糖化酶在pH6.5的檸檬酸鹽緩沖液中放置1、2、5h后，殘余的酶活力都在70%以上，隨著放置時間的延長，酶活力迅速降低，放置60h，殘余的酶活力僅在10%左右，所以該酶的耐酸穩(wěn)定性比較弱。

2.3.5 金屬離子對生淀粉糖化酶的酶活力的影響

由表2可知，Ca2+、Na+、K+、對該生淀粉糖化酶有激活作用，F(xiàn)e3+、Zn2+、Cu2+ 對該酶有抑制作用。

3  結(jié)論

   從自然界分離得到產(chǎn)生*的菌株QD006，通過形態(tài)和生理生化鑒定，初步確定為Staphylococcus intermedius，經(jīng)對該酶酶學性質(zhì)的研究，其zui適溫度為50℃，zui適pH為6.5，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，Ca2+、Na+、K+、對該生淀粉糖化酶有激活作用，F(xiàn)e3+、Zn2+、Cu2+ 對該酶有抑制作用。