來自Genomeweb的消息，加拿大公共的研究人員利用二代測序技術對血斑中艾滋病病毒基因進行測序，低成本地檢測HIV病毒抗藥性。此方法比基于PCR的對血漿樣品進行基因分型的成本更低，還可以更全面地了解艾滋病毒抗藥性信息。

一項發(fā)表于Antiviral Therapy雜志的初步研究中，加拿大國家艾滋病病毒及反轉錄病毒實驗室利用羅氏454 GS FLX系統(tǒng)對48位感染HIV-1病毒病人的血斑進行測序，研究病毒的抗藥性。這些樣本來自在2007年進行的一項研究，這些病人被診斷感染HIV-1，但尚未接受任何治療。

這次研究主要是為了確定是否能夠利用二代測序技術從已經(jīng)干燥的血斑中，鑒定抗藥性病毒株，并且降低其檢測成本。實驗中使用GS FLX系統(tǒng)進行測序，并將結果與Sanger方法進行比較。研究人員將樣本進行序列標記并混合后在GS FLX上測序，獲得3個相互重疊的擴增子序列，覆蓋了整個HIV-1 PR基因以及RT基因的前237個編碼子。

結果發(fā)現(xiàn)，454測序結果與Sanger方法相符，甚至檢測到一個Sanger法沒有檢測到的突變。文章的作者說道：“混合樣本的454焦磷酸測序是一個非常有效而經(jīng)濟的二代測序方法，尤其應用于干血斑的HIV病毒抗藥性發(fā)生率鑒定。這一方法有助于在有限的資源及配置下，低成本高通量地獲得HIV病毒抗藥性數(shù)據(jù)。”

加拿大HIV遺傳學實驗室主任James Brooks認為將血斑用于檢測相比血液有諸多優(yōu)勢，比如更容易進行收集儲存。收集血液樣本需要*，針頭，符合標準診所設置并從血液中分離細胞成分。而血斑只需要抽取很少的血液，在紙上進行干燥保存。除此之外，血液需要保存在零下八十度，這一條件對于許多實驗室是一個挑戰(zhàn)，而血斑可更簡單而長期的保存。

同時，他表示這次基因分型的實驗表明，對未接受治療的艾滋病患者的血液和血斑的檢測結果有很好的一致性，為下一步尋找低成本的病毒抗藥性篩選方法奠定了基礎。這一技術有望將原有實驗基因分型價格和商業(yè)測試價格分別降低40%和90%。

Brooks說，“雖然454的測序技術相對于其他二代測序系統(tǒng)價格略高，但是454的長度長特點非常適合我們所關注的HIV基因組的區(qū)段。而Ion Torrent的技術也有一定的特長，但是目前它的讀長還不夠長。所以這次454成為了贏家。”

歡迎索取454測序儀的資料

除了更加便宜之外，比起傳統(tǒng)方法二代測序方法可以更靈敏的發(fā)現(xiàn)變異基因。在初步研究中，即使在出現(xiàn)頻率大于20%的變異中，454發(fā)現(xiàn)了一個Sanger測序沒有發(fā)現(xiàn)的變異（其頻率約為20.4%）。如果測序深度進一步增加，二代測序可以發(fā)現(xiàn)頻率在1%的變異。研究人員下一步將決定測序深度，主要因素在于低頻率變異的臨床意義及重要性。Brooks說，“要決定測序深度并不容易，因為有證據(jù)表明一些低頻率的突變也導致抗藥性，而低頻率突變在人群中出現(xiàn)的幾率很小。”測序的深度也是影響檢測價格的因素之一。目前對于一些低頻率突變引起部分患者抗藥性的原因還不明確。

對于臨床來說，另外一個關鍵步驟是如何自動化這項檢測。從樣本制備到生物信息流程的建立，實驗小組正與加拿大微生物實驗室合作開發(fā)相關軟件。此外，對于已接受治療的患者，采取血斑是否合理還需進一步論證，因為在接受治療之后所采集的血斑中的病毒和血液中的病毒可能不同。

實驗室的zui終目標是建立一個從焦磷酸測序到直接產(chǎn)生抗藥性報告的一體化檢測方案。這一技術將推廣到加拿大以外的其他國家。比如世界衛(wèi)生組織HIV病毒抗藥性實驗室網(wǎng)絡中的其他實驗室。Brooks所在的實驗室也接受來自其他國家的樣本，通常是一些中低收入國家，實驗室贊助所有的檢測費用，一旦實驗成本可以有效降低，那么就可以提高更多的服務。

除此之外，這一技術也有望推廣到其他疾病比如肝炎。目前加拿大已經(jīng)著手用該方法對于丙肝病人的血斑中的病毒進行分型，以監(jiān)測丙型肝炎的發(fā)展趨勢，這一技術無疑對于降低基因分型成本有極大幫助。

關于454
454是*家新一代測序技術的*，基于焦磷酸測序的基本原理，將其優(yōu)化為迄今為止可達1Kbp單一序列讀長的測序平臺，以其長序列讀長測序保持著在領域內(nèi)無法替代的應用地位；2007年位于美國Branford 的454公司被羅氏收購，整合至羅氏診斷應用科學部，成為其zui重要的產(chǎn)品線之一，為探索新一代測序技術在人類健康事業(yè)中的應用而奮力前行。