·CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備的實驗步驟

　　1．前夜接種受體菌（DH5α或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；

　　2．取1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于100mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-3小時（250-300rpm）；

　　3．將0.1MCaCl2溶液置于冰上預(yù)冷；

　　以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作

　　4．吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

　　5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

　　6．棄去上清，加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；

　　7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

　　8．棄去上清，加入100μl預(yù)冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮；

　　9．細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護(hù)劑（15%-20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃）。

　　·電轉(zhuǎn)化法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的實驗步驟

　　1．前夜接種受體菌（DH5α或DH10B），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37℃搖床培養(yǎng)過夜；

　　2．取2ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于200mlLB培養(yǎng)基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6（約2.5-3小時）；

　　3．將菌液迅速置于冰上。以下步驟務(wù)必在超凈工作臺和冰上操作

　　4．吸取1.5ml培養(yǎng)好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；

　　5．4℃下3000g冷凍離心5分鐘；

　　6．棄去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；

　　7．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

　　8．棄去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；

　　9．4℃下3000g冷凍離心5分鐘

　　10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；

　　11．立即使用或迅速置于-70℃超低溫保存。

　　附注：

　　影響感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率的因素及實際操作過程中應(yīng)注意的事項：

　　1．細(xì)菌的生長狀態(tài)：實驗中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5α菌株OD600為0.5時細(xì)胞密度是5×107/ml）；

　　2．所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；

　　3．經(jīng)CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉(zhuǎn)化率隨時間的推移而增加，24小時達(dá)到zui高，之后轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時間延長而減少造成的）；

　　4．化合物及無機(jī)離子的影響：在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（100-1000倍）；

　　5．所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；

　　6．質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是超螺旋的DNA；

　　7．一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度呈正比；