Western Blot樣品處理方法
1．培養(yǎng)的細(xì)胞（定性）：
⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。
⑵ 對于6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶ 100℃，1min。
⑷ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞后在EP管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。
⑸ 用干凈的針尖挑絲，如有團(tuán)塊則將團(tuán)塊棄掉，如果沒有團(tuán)塊但有拉絲現(xiàn)象，則可以將EP管置于0℃后在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團(tuán)塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反復(fù)抽吸來降低溶液粘滯度，便于上樣。
⑹ 待樣品恢復(fù)到室溫后上樣。
2．培養(yǎng)的細(xì)胞（定量）：
⑴ 去培養(yǎng)液后用溫的PBS沖洗2~3遍（冷的PBS有可能使細(xì)胞脫落）。
⑵ 加入適量的冰預(yù)冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶ 用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g離心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清進(jìn)行定量。
⑹ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3．組織：
⑴ 勻漿 對于心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液?？墒謩踊螂妱觿驖{。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
⑵ 12000g離心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清進(jìn)行定量。
⑷ 將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上樣，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃一個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM
由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加Na3VO4 0.1mM及NaF 25mM）。
1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巰基乙醇，0.2~0.5‰溴酚藍(lán)，2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×，注意SDS終濃度勿超過10%。
對于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用5%的SDS，肝腎等組織2%即可。)
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