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當(dāng)前位置:上海宸功生物技術(shù)有限公司>>技術(shù)文章>>軟瓊脂細(xì)胞克隆試劑盒檢驗(yàn)的步驟說(shuō)明
軟瓊脂細(xì)胞克隆試劑盒特別適用于動(dòng)物或人體轉(zhuǎn)化型體細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的生長(zhǎng)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌,即到即用,性能穩(wěn)定,操作簡(jiǎn)便,重復(fù)一致。
實(shí)驗(yàn)步驟如下:
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將4℃冰箱里的試劑盒中的所有試劑溶液放進(jìn)37℃恒溫水浴里預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。
一、 細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2)操作
1. 將克隆液(Reagent A)置于微波爐里加熱溶化(注意:避免溢出)
2. 放進(jìn)50℃恒溫水浴
3. 移出15毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液(Reagent B)到50毫升錐形離心管
4. 移出15毫升克隆液(Reagent A)到50毫升錐形離心管
5. 輕度渦旋震蕩或用手搖動(dòng)錐形離心管,充分混勻
6. 最快速度分別移入3毫升(每個(gè)3毫升)到10個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶
7. 用手輕輕抖動(dòng),鋪滿整個(gè)底面,避免氣泡產(chǎn)生
8. 置于室溫下至少2小時(shí),使膠體凝固
9. 準(zhǔn)備1瓶25cm2或75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞,清洗,脫落,計(jì)數(shù)
10. 移出1毫升(總量為2500個(gè)細(xì)胞)到15毫升錐形離心管
11. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
12. 小心抽去上清液
13. 加入2.25毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液(Reagent C),用槍頭上下輕柔抽吸混勻(注意:用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)
14. 加入750微升克隆液(Reagent A),用槍頭上下輕柔抽吸混勻
15. 最快速度全部移入到1個(gè)25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶里,置于已凝固的膠體上面
16. 用手輕輕抖動(dòng),鋪滿整個(gè)底面,避免氣泡產(chǎn)生
17. 置于室溫下至少2小時(shí),使膠體凝固
18. 放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育
19. 次日,輕輕加入3毫升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面(注意:用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)
20. 1周后,再次加入3毫升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面
21. 2周后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞:細(xì)胞集落形成能力和效率(Clonogenicity/Efficiency),包括細(xì)胞集落數(shù)目、細(xì)胞集落大小,以及貼壁非依賴型生長(zhǎng)等
22. (選擇步驟)小心抽去低養(yǎng)液(Reagent D)
23. (選擇步驟)用細(xì)胞刮脫棒小心刮落含有細(xì)胞集落的中養(yǎng)層
24. (選擇步驟)用1000微升槍頭(翦去頂端部分)吸出細(xì)胞集落
25. (選擇步驟)加入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶
26. (選擇步驟)加入3毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
27. (選擇步驟)用5毫升移液管抽吸,充分打碎細(xì)胞集落
28. (選擇步驟)放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育
二、細(xì)胞培養(yǎng)板(12孔板)操作
1. 將克隆液(Reagent A)置于微波爐里加熱溶化(注意:避免溢出)
2. 放進(jìn)50℃恒溫水浴
3. 移出10毫升預(yù)熱的高養(yǎng)液(Reagent B)到50毫升錐形離心管
4. 移出10毫升克隆液(Reagent A)到50毫升錐形離心管
5. 輕度渦旋震蕩或用手搖動(dòng)錐形離心管,充分混勻
6. 最快速度分別移入1.5毫升(每孔1.5毫升)到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的每個(gè)孔里
7. 用手輕輕抖動(dòng),鋪滿整個(gè)底面,避免氣泡產(chǎn)生
8. 置于室溫下至少2小時(shí),使膠體凝固
9. 準(zhǔn)備1瓶25cm2或75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞,清洗,脫落,計(jì)數(shù)
10. 移出1毫升(總量為2500個(gè)細(xì)胞)到15毫升錐形離心管
11. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為300g
12. 小心抽去上清液
13. 加入1.125毫升預(yù)熱的中養(yǎng)液(Reagent C),用槍頭上下輕柔抽吸混勻(注意:用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)
14. 加入375微升克隆液(Reagent A),用槍頭上下輕柔抽吸混勻
15. 最快速度全部移入到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)孔里,置于已凝固的膠體上面
16. 用手輕輕抖動(dòng),鋪滿整個(gè)底面,避免氣泡產(chǎn)生
17. 置于室溫下至少2小時(shí),使膠體凝固
18. 放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育
19. 次日,輕輕加入500微升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面(注意:用戶可以加入細(xì)胞因子、篩選藥物等)
20. 1周后,再次加入500微升低養(yǎng)液(Reagent D)在膠體上面
21. 2周后,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞:細(xì)胞集落形成能力和效率(Clonogenicity/Efficiency),包括細(xì)胞集落數(shù)目、細(xì)胞集落大小,以及貼壁非依賴型生長(zhǎng)等
22. (選擇步驟)小心抽去低養(yǎng)液(Reagent D)
23. (選擇步驟)用細(xì)胞刮脫棒小心刮落含有細(xì)胞集落的中養(yǎng)層
24. (選擇步驟)用1000微升槍頭(翦去頂端部分)吸出細(xì)胞集落
25. (選擇步驟)加入到25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板的1個(gè)孔里
26. (選擇步驟)加入3毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
27. (選擇步驟)用5毫升移液管抽吸,充分打碎細(xì)胞集落
28. (選擇步驟)放進(jìn)37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育
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