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一、測定原理:
谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT) 在 37℃及 PH7.4 條件下,作用于及α-酮戊二酸組成的底物,生成丙酮酸及。反應 30min 后 (固定時間) 加入 肼 (DNPH) 鹽酸溶 液,既中止反應, 同時 DNPH 與酮酸中羰基加成,生成丙酮 酸苯腙。苯腙在堿性條件下呈紅棕色,于 505nm 比讀吸光度 并計算酶活力。
二、試劑的組成與配制:(96T)
試劑一:谷丙轉(zhuǎn)氨酶基質(zhì)液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 6 個月; 試劑二肼液,5mL×1 瓶,4℃冰箱保存 6 個月; 試劑三:4mol/L 氫氧化鈉液,5mL×1 瓶,室溫密封保存 6 個月; 0.4mol/L 氫氧化鈉液的配制, 臨用時按 4mol/L 氫氧化鈉液:雙
蒸水=1 ∶9 的比例稀釋,需多少配多少,室溫密封保存。 試劑四:2mol/mL 丙酮酸鈉標準液×1 支,4℃冰箱保存 6 個月; 試劑五:0. 1mol/L 磷酸鹽緩沖液×1 支,4℃冰箱保存 6 個月。
三、操作過程:
1 、樣本前處理:
①、血清 (漿) 及其它液體樣本待測:直接測定。
② 、動物組織樣本:準確稱取組織重量,按重量 (g) :體積 (mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體積的生理鹽水,冰水浴條件 下機械勻漿,2500 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,取上清液待測。
③ 、培養(yǎng)細胞樣本前處理:將收集好的細胞用等滲緩沖液 (推 薦 0.1mol/L pH7~7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水) 清洗 1~
2 次;1000 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,棄上清, 留細胞沉淀,加入勻 漿介質(zhì) (推薦加入 0.1mol/L pH7~7.4 磷酸鹽緩沖液或生 理鹽水) ,冰水浴條件
1 、比色法中常用的有賴氏 (Reitman-Frankel) 法及金氏 (King) 法。賴氏法標準曲線所定單位數(shù),是用實驗方法和卡門氏分 光 光度法 (速率法) 作對比測定求得的。 以卡門氏單位報 告結(jié)果,比較準確。
卡門氏單位定義:1mL 液體,反應液總?cè)萘?/span> 3mL ,波長 340nm, 1cm 光徑,25℃ ,1min 內(nèi)所生成的丙酮酸,使 NADH 氧化 成 NAD+而引起吸光度每下降 0.001 為一個單位 ( 1 卡門氏 單位=0.482 U/L ,25℃) 。
2 、一般血清標本內(nèi)源性酮酸很少,血清對照孔吸光度值接近試 劑空白孔 (以雙蒸水代替血清,其他和對照孔同樣操作) 。 所以,成批標本測定時,一般不需要每一標本都作本身血清 對照孔, 以試劑空白孔代替即可,但對脂血、黃疸或溶血血 清,每份標本應作對照孔。
3 、酶活力超過 150 卡門氏單位時,用生理鹽水稀釋血清后重測。
4 、應將一般血清的對照孔 (或稱標本空白孔) 的吸光度作為日 常質(zhì)控的指標之一;如相差大,可考慮α-酮戊二酸濃度、DNPH 濃度及儀器等原因引起。
5 、血清中ALT 在室溫 (25℃) 可保存 2 天,在 0~4℃可保存一 周,在-25℃可保存 1 個月。
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