動物細胞/組織線粒體粗提分離試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
動物細胞/組織線粒體粗提分離試劑是一種旨在從動物細胞或組織中分離出完整而純化的線粒體細胞器的
而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于動物軟組織（肝或腦組織）和培
養(yǎng)細胞的線粒體的制備。其制備物產(chǎn)量高，可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、能量代謝、蛋白組學(xué)和病理
生理學(xué)等的研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量和純度堪稱同類產(chǎn)品zui
佳。
技術(shù)背景
線粒體細胞器的分離是現(xiàn)代細胞生物學(xué)研究的zui常用的手段之一。從任何組織或細胞分離線粒體的技術(shù)方
法基本上采用：*，通過機械或化學(xué)方法破裂細胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞
器；第三，通過高速差速離心獲得線粒體；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的線粒體。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
凈化液（Reagent C） 毫升
強化液（Reagent D） 毫升
保存液（Reagent E） 毫升
說明書1 份
保存方式
保存凈化液（Reagent C）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6 月
用戶自備
HANK 平衡鹽緩沖溶液或PBS 緩沖溶液：用于清理細胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細胞脫離
*細胞培養(yǎng)液：用于細胞處理所需的培養(yǎng)基
15 毫升錐形離心管：用于線粒體初步制備物的存放
50 毫升錐形離心管：用于細胞或組織收集后離心或清洗
1.5 毫升離心管：用于保存線粒體
4℃臺式離心機：用于沉淀細胞
4℃超速離心機：用于分離細胞器成分
DOUNCE 勻漿器：用于裂解細胞
實驗步驟
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一、動物軟組織線粒體分離（組織勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx 毫升凈化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。
然后進行下列操作。
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1 克組織重量（實驗前使動物空腹12 至24 小時）
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的50 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進一個預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
6． 加入xx 毫升預(yù)冷的裂解工作液
7． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
8． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20 至40 下）（注意：參見注意事項8）
10．將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
11．放進4℃臺式離心機離心10 分鐘，速度為1500g
12．小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
13．放進4℃超速離心機離心10 分鐘，速度為10000g
14．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA 萃取，直接進入線粒體DNA 萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
15．（選擇步驟）加入xx 毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
16．（選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5 分鐘，速度為10000g
17．（選擇步驟）小心抽去上清液
18．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混勻
19．即刻移入1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里
二、動物軟組織線粒體分離（化學(xué)處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx 毫升凈化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。
然后進行下列操作。
1． 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定1 克組織重量（實驗前使動物空腹12 至24 小時）
2． （選擇步驟）放進預(yù)冷的50 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 移入一個液氮凍存管
5． 即刻放入液氮罐過夜
6． 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
7． 放進一個15 毫升錐形離心管
8． 加入xx 毫升預(yù)冷的裂解工作液
9． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
10．在冰槽里孵育2 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒一次
3
11．加入xx 微升預(yù)冷的強化液（Reagent D）
12．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
13．在冰槽里孵育5 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒二次（注意：參見注意事項9）
14．加入xx 毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
15．放進4℃臺式離心機離心10 分鐘，速度為1500g
16．小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
17．放進4℃超速離心機離心10 分鐘，速度為10000g
18．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA 萃取，直接進入線粒體DNA 萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
19．（選擇步驟）加入xx 毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
20．（選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5 分鐘，速度為10000g
21．（選擇步驟）小心抽去上清液
22．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混勻
23．即刻移入1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里
三、動物細胞線粒體分離（細胞勻漿法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx 毫升凈化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。
然后進行下列操作。
1． 準備5 至10 瓶75cm2 細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
2． 分別加入10 毫升用戶自備的HANK 平衡鹽緩沖溶液或PBS 緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶
表面，然后抽去
3． 重復(fù)實驗步驟2 一次
4． 加入3 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3 分種
6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落，
7． 分別加入10 毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
8． 移入一個50 毫升錐形離心管
9． 放進臺式離心機離心10 分鐘，速度為200g
10．小心抽去上清液
11．加入xx 毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細胞
12．放進臺式離心機離心10 分鐘，速度為300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx 毫升預(yù)冷的裂解工作液
15．渦旋震蕩5 秒，充分混勻細胞顆粒群
16．即刻放進預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
17．在冰槽里用勻漿棒勻化細胞（約20 至40 下）（注意：參見注意事項8）
18．將所有細胞勻漿物移入15 毫升錐形離心管
19．放進4℃臺式離心機離心10 分鐘，速度為1500g
20．小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
21．放進4℃超速離心機離心10 分鐘，速度為10000g
22．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
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（注意：如果進行線粒體DNA 萃取，直接進入線粒體DNA 萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
23．（選擇步驟）加入xx 毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
24．（選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5 分鐘，速度為10000g
25．（選擇步驟）小心抽去上清液
26．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混勻
27．即刻移入1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里
四、動物細胞線粒體分離（化學(xué)處理法）
實驗開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出xx 毫升凈化液（Reagent C）和
xx 毫升的裂解液（Reagent B）到15 毫升錐形離心管里，混勻后，標記為裂解工作液，放進冰槽里備用。
然后進行下列操作。
1． 準備5 至10 瓶75cm2 細胞培養(yǎng)瓶的細胞（5 X 107），直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
2． 分別加入10 毫升用戶自備的HANK 平衡鹽緩沖溶液或PBS 緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶
表面，然后抽去
3． 重復(fù)實驗步驟2 一次
4． 加入3 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細胞生長表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3 分種
6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細胞脫落
7． 分別加入10 毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
8． 移入一個50 毫升錐形離心管
9． 放進臺式離心機離心10 分鐘，速度為200g
10．小心抽去上清液
11．加入xx 毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A）
12．放進臺式離心機離心10 分鐘，速度為300g
13．小心抽去上清液
14．加入xx 毫升預(yù)冷的裂解工作液
15．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
16．在冰槽里孵育2 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒一次
17．加入xx 微升預(yù)冷的強化液（Reagent D）
18．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
19．在冰槽里孵育5 分鐘，期間渦旋震蕩5 秒二次（注意：參見注意事項9）
20．加入xx 毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動試管混勻
21．放進4℃臺式離心機離心10 分鐘，速度為1500g
22．小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——此步驟去除細胞核和未溶解的細胞
23．放進4℃超速離心機離心10 分鐘，速度為10000g
24．小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
（注意：如果進行線粒體DNA 萃取，直接進入線粒體DNA 萃取試劑盒的步驟4，繼續(xù)下去）
25．（選擇步驟）加入xx 毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
26．（選擇步驟）放進4℃超速離心機再次離心5 分鐘，速度為10000g
27．（選擇步驟）小心抽去上清液
28．加入xx 毫升保存液（Reagent E），充分混勻
29．即刻移入1.5 毫升離心管，放進－70℃冰箱里
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注意事項
1． 本產(chǎn)品為10 次（1 克動物組織或5 X 107 細胞）或50 次（200 毫克動物組織或1 X 107 細胞）操作
2． 實際操作的動物組織重量或細胞量與試劑使用量按比例調(diào)整：例如200 毫克動物組織：試劑用量是標
準用量的五分之一
3． 所有操作均須嚴格在4℃或以下狀態(tài)進行
4． 操作時，須戴手套
5． 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
6． 建議使用足夠的樣品量
7． 建議嚴格控制操作時間
8． 通常勻化次數(shù)為20 至40 下（或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但
不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3 微升勻漿物的細胞裂解程度：完整細
胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
9． 通常孵育5 分鐘（不宜超過5 分鐘）達到80％的細胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織或細胞類型會存
在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3 微升裂解物的細胞裂解程度：完整細胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50
％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
10．對于難以裂解的細胞，例如HeLa 細胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
11．通常1 克動物組織或5 X 107 細胞的線粒體含量為50 微克以上線粒體蛋白
12．如果需要計量線粒體，稀釋后數(shù)分鐘內(nèi)完成，否則線粒體將分解
13．本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量zui為理想。通過調(diào)整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提
的線粒體純化程度，但線粒體產(chǎn)量相應(yīng)減少
14．如果需要獲得99％以上純度的線粒體，使用動物細胞/組織高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒
15．線粒體正?；钚詼y定方法是： CITRATE SYNTHASE 活性、氧化磷酸化、細胞色素吸收峰譜等
16．線粒體內(nèi)外膜完整測定方法是：CYTOCHROME C OXIDASE 活性和熒光JC 染色
17．本公司提供線粒體套餐：ROS、NAO、MitoTRACK、JGB、線粒體溶解等
18．本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標準
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體內(nèi)外膜完整
3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的線粒體維持正?；钚?br />4． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶