純化線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑盒
產(chǎn)品說明書
主要用途
純化線粒體膜通道孔（MPTP）熒光檢測(cè)試劑是一種旨在通過鈣黃綠素載入后離心處理或鈷
淬滅技術(shù)，選擇性地聚集在線粒體內(nèi)呈現(xiàn)熒光染色，而存在于或由線粒體釋放到線粒體外的
熒光染料，即刻發(fā)生熒光去除或淬滅，來(lái)分析和觀察線粒體膜通道孔活性的而經(jīng)典的技
術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種純化線粒體膜通
道孔活性（瞬時(shí)或開放狀態(tài)）的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，活體檢測(cè)，分辨率高，
操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
線粒體膜通道孔（mitochondrial permeability transition pore；MPTP）是由線粒體內(nèi)外膜成分
構(gòu)成的非特異性且鈣離子依賴性通道。在細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)，線粒體內(nèi)容物通過膜通道孔釋
放到胞漿中。膜通道孔的開放，顯著改變線粒體的通透性。鈣離子過度進(jìn)入、線粒體谷胱苷
肽的氧化和活性氧族水平的增加等導(dǎo)致膜通道孔的持續(xù)開放，而造成細(xì)胞色素C 的釋放和
線粒體膜電位的消失。鈣黃綠素－AM，又稱雙甲亞胺二乙酸鈉熒光素－乙酰氧基甲基酯【bis
（bis－carboxymethyl amino methyl fluorescein）－acetoxymethyl ester】，作為熒光探針：第
一，適宜的分子量622kd，小于1.5kd；第二，幾乎不具有膜結(jié)合性；第三，不是線粒體酶
的底物；第四，容易進(jìn)入細(xì)胞及其線粒體。鈣黃綠素-AM 進(jìn)入線粒體后，被內(nèi)酯酶切離，
產(chǎn)生具有極性的熒光性強(qiáng)的鈣黃綠素，被線粒體俘獲。同時(shí)線粒體外的鈣黃綠素通過離心去
除或受到其淬滅劑鈷離子的淬滅。一旦線粒體膜通道孔瞬時(shí)開放，鈣黃綠素釋放出線粒體外，
由于離心處理或被鈷離子淬滅。線粒體內(nèi)鈣黃綠素?zé)晒獾淖兓?，表明膜通道孔的開放狀態(tài)。
產(chǎn)品內(nèi)容
染色液（Reagent A） X 微升
中和液（Reagent B） X 毫升
保存液（Reagent C） X 毫升
說明書1 份
保存方式
保存染色液（Reagent A）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證
6 個(gè)月
用戶自備
96 孔酶標(biāo)板：用于線粒體熒光分析的容器
1.5 毫升離心管：用于線粒體染色的容器
載波片/蓋玻片：用于線粒體樣品存放后熒光分析
微型臺(tái)式離心機(jī)：用于沉淀線粒體
培養(yǎng)箱：用于染色孵育
（共聚焦）熒光顯微鏡：用于線粒體熒光分析
熒光分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于線粒體熒光定量分析
實(shí)驗(yàn)步驟
一、直接法
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品
2． 移取100 微升線粒體樣品（總量為2 毫克）到1.5 毫升離心管
3． 加入X 微升染色液（Reagent A），混勻
4． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15 分鐘，避免光照
5． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）
6． 小心抽去上清液
7． 加入X 微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent C），混勻顆粒群
8． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）
9． 小心抽去保存液（Reagent C）
10．小心加入X 微升37℃預(yù)熱的保存液（Reagent C），混勻顆粒群
11． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
（A）使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：
1）移取10 微升上述懸液到載波片上，蓋上蓋玻片
2）激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――
綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
（B） 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：
1）移取100 微升上述懸液到100 微升比色杯或96 孔酶標(biāo)板
2）即刻放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――
RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
二、間接法
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent A）置入冰槽里融化，中和液
（Reagent B）放進(jìn)37℃恒溫水槽里預(yù)熱。然后移出10 微升染色液（Reagent A）到新的1.5
毫升離心管，加入100 微升中和液（Reagent B），混勻后，標(biāo)記為染色工作液，置入暗室里。
然后進(jìn)行下列操作。
1． 準(zhǔn)備好待測(cè)的純化線粒體樣品
2． 移取100 微升線粒體樣品（總量為2 毫克）到1.5 毫升離心管
3． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5 分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf
5415）
4． 小心抽去上清液
5． 加入X 微升含有染色液（Reagent A）和中和液（Reagent B）的染色工作液，充分混
勻
6． 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育15 分鐘，避免光照
7． 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
a) 使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：
1）移取10 微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片（每隔5 分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30 分
鐘）
2）激發(fā)波長(zhǎng)488nm，散發(fā)波長(zhǎng)505nm――綠色熒光減弱，表明膜通道孔活性（MPTP）增
強(qiáng)
b) 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：
1） 移取100 微升上述懸液到100 微升比色杯或96 孔酶標(biāo)板
2） 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀（每隔5 分鐘檢測(cè)一次，持續(xù)30 分鐘）：激發(fā)波長(zhǎng)488nm，
散發(fā)波長(zhǎng)505nm――RFU 降低，表明膜通道孔活性（MPTP）增強(qiáng)
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為20 次操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 染色前，所有試劑溶液，除染色液（Reagent A）外，需37℃預(yù)熱
4． 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
5． 孵育時(shí)，必須避免光照
6． 本產(chǎn)品友好使用于雙重染色或重疊染色
7． 如果不具備505nm 散發(fā)波長(zhǎng)的濾波器，可以使用505nm 至530nm 中的任一波長(zhǎng)
8． 如果膜通道孔為瞬時(shí)開放（transient），則熒光緩慢且自發(fā)降低
9． 本公司提供膜通道孔抑制劑：0.2 毫摩爾環(huán)胞素A（cyclosporine A），維護(hù)熒光完整
10．本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰