細(xì)胞/組織高爾基體粗提分離試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
主要用途
細(xì)胞/組織高爾基體粗提分離試劑是一種旨在通過(guò)機(jī)械或化學(xué)處理，差速以及等密度離心方法，從動(dòng)物細(xì)胞
或軟組織中分離出完整的高爾基體細(xì)胞器組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)
證明的。適合于各種動(dòng)物細(xì)胞或組織（人體、老鼠、兔子等）樣品中高爾基體的制備。可以被用于受體循
環(huán)、糖蛋白和脂蛋白合成，以及抗體釋放機(jī)制等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)
定，分離產(chǎn)量高。
技術(shù)背景
高爾基體（Golgi apparatus或Golgi body），又稱(chēng)為高爾基復(fù)合體（Golgi complex），是大多數(shù)真核細(xì)胞的細(xì)
胞器組分，由40至100扁平片層或稱(chēng)為小池（cisternae）堆疊成內(nèi)膜系統(tǒng)（endomembrane system），分成正
側(cè)或內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)（cis-Golgi network）、近內(nèi)中間網(wǎng)絡(luò)（medial-Golgi）、內(nèi)腔網(wǎng)絡(luò)（endo-Golgi）、外側(cè)或反側(cè)網(wǎng)
絡(luò)等（trans-Golgi）細(xì)胞內(nèi)小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，
其主要功能在于由內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)接受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡中的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)等生物大分子，處理（修飾、分類(lèi)）和組裝
后，由外側(cè)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)分泌到目標(biāo)位置。同時(shí)也是合成蛋白聚糖（proteoglycan）和碳水化合物的重要場(chǎng)所。
高爾基體的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一：*，通過(guò)機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞；第二，
通過(guò)低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器；第三，可以通過(guò)等密度離心獲得高爾基體。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
分離液A（Reagent C） 毫升
分離液B（Reagent D） 毫升
保存液（Reagent E） 毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)1 份
保存方式
保存在4℃冰箱里，有效保證6 月
用戶(hù)自備
HANK 平衡鹽緩沖溶液或PBS 緩沖溶液：用于清理細(xì)胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液：用于細(xì)胞脫離
*細(xì)胞培養(yǎng)液：用于中和胰蛋白酶的細(xì)胞培養(yǎng)基
15 毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器
1.5 毫升離心管：用于樣品保存的容器
8 毫升超速離心管：用于超高速離心的容器
2
4℃（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備
4℃超速離心機(jī)：用于樣品制備
DOUNCE 勻漿器：用于裂解組織
平式搖蕩儀：用于混勻
3 號(hào)針筒和18 號(hào)針頭：用于收集樣品
實(shí)驗(yàn)步驟
一、細(xì)胞樣品
1． 準(zhǔn)備5 至10 瓶75cm2 細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 107），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)表面
2． 分別加入10 毫升用戶(hù)自備的HANK 平衡鹽緩沖溶液或PBS 緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶
表面，然后抽去
3． 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2 一次
4． 加入3 毫升用戶(hù)自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
5． 置入37℃培養(yǎng)箱3 分種
6． 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
7． 分別加入10 毫升用戶(hù)自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
8． 移入一個(gè)50 毫升錐形離心管
9． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為200g
10．小心抽去上清液
11．加入xx 毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
12．放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10 分鐘，速度為300g
13．小心抽去上清液
14．加入預(yù)冷的xx 毫升裂解液（Reagent B）
15．渦旋震蕩5 秒，充分混勻
16．即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
17．在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20 至40 下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）
18．將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
19．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心15 分鐘，速度為3000g
20．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——
21．放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
22．移取xx 毫升的分離液A（Reagent C）到8 毫升超速離心管
23．小心加入xx 毫升的分離液B（Reagent D）在分離液A（Reagent C）的上面，避免震動(dòng)
24．輕輕加入xx 毫升上述高爾基體混勻液在分離液B（Reagent D）的上面，避免震動(dòng)
25．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心4 小時(shí)，速度為100000g
26．小心取出超速離心管：可見(jiàn)樣品和分離液B（Reagent D）交界處棕色或乳黃色樣品帶
27．小心收集高爾基體樣品帶到8 毫升超速離心管（注意：用3 毫升針筒和18 號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小
心緩慢抽吸）
28．加入xx 毫升保存液（Reagent E）
29．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30 分鐘，速度為100000g
30．小心抽去上清液
31．加入xx 微升保存液（Reagent E），混勻
32．即刻移入到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
3
33．放進(jìn)－70℃冰箱里保存
二、組織樣品
1． 手術(shù)取出動(dòng)物組織，避免或去除脂肪組織，秤重以確定1 克組織重量（實(shí)驗(yàn)前使動(dòng)物空腹12 至
24 小時(shí)）
2． （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
3． （選擇步驟）加入xx 毫升清理液（Reagent A）清洗1 次
4． 即刻用刀片切碎組織
5． 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
6． 加入預(yù)冷的xx 毫升裂解液（Reagent B）
7． 渦旋震蕩5 秒，充分混勻
8． 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
9． 在冰槽里用勻漿棒勻化組織（約20 至40 下）（注意：參見(jiàn)注意事項(xiàng)7）
10．將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
11．放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心15 分鐘，速度為3000g
12．小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——
13．放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
14．移取xx 毫升的分離液A（Reagent C）到8 毫升超速離心管
15．小心加入xx 毫升的分離液B（Reagent D）在分離液A（Reagent C）的上面，避免震動(dòng)
16．輕輕加入xx 毫升上述高爾基體混勻液在分離液B（Reagent D）的上面，避免震動(dòng)
17．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心4 小時(shí)，速度為100000g
18．小心取出超速離心管：可見(jiàn)樣品和分離液B（Reagent D）交界處棕色或乳黃色樣品帶
19．小心收集高爾基體樣品帶到8 毫升超速離心管（注意：用3 毫升針筒和18 號(hào)針頭，置于樣品帶下緣小
心緩慢抽吸）
20．加入xx 毫升保存液（Reagent E）
21．放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心30 分鐘，速度為100000g
22．小心抽去上清液
23．加入xx 微升保存液（Reagent E），混勻
24．即刻移入到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
25．放進(jìn)－70℃冰箱里保存
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為10 次（1 克動(dòng)物組織或5 X 107 細(xì)胞）操作
2． 操作時(shí)，須戴手套
3． 操作時(shí)，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、分離液A/B（Reagent C/D）和保存液（Reagent
E）
4． 所有操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)進(jìn)行
5． 建議使用足夠的樣品量
6． 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
7． 通常勻化次數(shù)為20 至40 下（或細(xì)胞顆粒群/組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但
不同的組織或細(xì)胞類(lèi)型會(huì)存在差異。用戶(hù)可以通過(guò)顯微鏡觀察3 微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)
胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
4
8． 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整分離液A/B（Reagent C/D）的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿(mǎn)
9． 通常1 克動(dòng)物組織的高爾基體含量為15 微克蛋白
10．本產(chǎn)品所獲得的高爾基體純度和產(chǎn)量zui為理想
11．高爾基體的標(biāo)志蛋白是UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-glactosyl transferase）；建議使用純化高爾基體UDP半
乳糖轉(zhuǎn)移酶（UDP-glactosyl transferase）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒
12．本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的高爾基體維持正常活性
3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶