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上海宸功生物技術(shù)有限公司
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細胞/組織高爾基體粗提分離試劑盒

時間:2017/1/18閱讀:1615
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細胞/組織高爾基體粗提分離試劑盒

產(chǎn)品說明書
主要用途
細胞/組織高爾基體粗提分離試劑是一種旨在通過機械或化學(xué)處理,差速以及等密度離心方法,從動物細胞
或軟組織中分離出完整的高爾基體細胞器組分的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗
證明的。適合于各種動物細胞或組織(人體、老鼠、兔子等)樣品中高爾基體的制備??梢员挥糜谑荏w循
環(huán)、糖蛋白和脂蛋白合成,以及抗體釋放機制等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶,即到即用,性能穩(wěn)
定,分離產(chǎn)量高。
技術(shù)背景
高爾基體(Golgi apparatus或Golgi body),又稱為高爾基復(fù)合體(Golgi complex),是大多數(shù)真核細胞的細
胞器組分,由40至100扁平片層或稱為小池(cisternae)堆疊成內(nèi)膜系統(tǒng)(endomembrane system),分成正
側(cè)或內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)(cis-Golgi network)、近內(nèi)中間網(wǎng)絡(luò)(medial-Golgi)、內(nèi)腔網(wǎng)絡(luò)(endo-Golgi)、外側(cè)或反側(cè)網(wǎng)
絡(luò)等(trans-Golgi)細胞內(nèi)小管(tubules)、囊泡(vesicles)和小池(cisternae/sac)相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),
其主要功能在于由內(nèi)側(cè)網(wǎng)絡(luò)接受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡中的蛋白質(zhì)和脂類等生物大分子,處理(修飾、分類)和組裝
后,由外側(cè)網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運分泌到目標(biāo)位置。同時也是合成蛋白聚糖(proteoglycan)和碳水化合物的重要場所。
高爾基體的分離是現(xiàn)代細胞生物學(xué)研究的常用手段之一:*,通過機械或化學(xué)方法破裂組織細胞;第二,
通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細胞器;第三,可以通過等密度離心獲得高爾基體。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 毫升
裂解液(Reagent B) 毫升
分離液A(Reagent C) 毫升
分離液B(Reagent D) 毫升
保存液(Reagent E) 毫升
產(chǎn)品說明書1 份
保存方式
保存在4℃冰箱里,有效保證6 月
用戶自備
HANK 平衡鹽緩沖溶液或PBS 緩沖溶液:用于清理細胞
胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液:用于細胞脫離
*細胞培養(yǎng)液:用于中和胰蛋白酶的細胞培養(yǎng)基
15 毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
1.5 毫升離心管:用于樣品保存的容器
8 毫升超速離心管:用于超高速離心的容器
2
4℃(微型)臺式離心機:用于樣品制備
4℃超速離心機:用于樣品制備
DOUNCE 勻漿器:用于裂解組織
平式搖蕩儀:用于混勻
3 號針筒和18 號針頭:用于收集樣品
實驗步驟
一、細胞樣品
1. 準(zhǔn)備5 至10 瓶75cm2 細胞培養(yǎng)瓶的細胞(5 X 107),直至細胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面
2. 分別加入10 毫升用戶自備的HANK 平衡鹽緩沖溶液或PBS 緩沖溶液到每個細胞培養(yǎng)瓶,覆蓋培養(yǎng)瓶
表面,然后抽去
3. 重復(fù)實驗步驟2 一次
4. 加入3 毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個細胞生長表面
5. 置入37℃培養(yǎng)箱3 分種
6. 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶,使細胞脫落
7. 分別加入10 毫升用戶自備的*細胞培養(yǎng)液
8. 移入一個50 毫升錐形離心管
9. 放進臺式離心機離心10 分鐘,速度為200g
10.小心抽去上清液
11.加入xx 毫升預(yù)冷的清理液(Reagent A),混勻細胞
12.放進臺式離心機離心10 分鐘,速度為300g
13.小心抽去上清液
14.加入預(yù)冷的xx 毫升裂解液(Reagent B)
15.渦旋震蕩5 秒,充分混勻
16.即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
17.在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約20 至40 下)(注意:參見注意事項7)
18.將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
19.放進4℃臺式離心機離心15 分鐘,速度為3000g
20.小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——
21.放進-70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
22.移取xx 毫升的分離液A(Reagent C)到8 毫升超速離心管
23.小心加入xx 毫升的分離液B(Reagent D)在分離液A(Reagent C)的上面,避免震動
24.輕輕加入xx 毫升上述高爾基體混勻液在分離液B(Reagent D)的上面,避免震動
25.放進4℃超速離心機離心4 小時,速度為100000g
26.小心取出超速離心管:可見樣品和分離液B(Reagent D)交界處棕色或乳黃色樣品帶
27.小心收集高爾基體樣品帶到8 毫升超速離心管(注意:用3 毫升針筒和18 號針頭,置于樣品帶下緣小
心緩慢抽吸)
28.加入xx 毫升保存液(Reagent E)
29.放進4℃超速離心機離心30 分鐘,速度為100000g
30.小心抽去上清液
31.加入xx 微升保存液(Reagent E),混勻
32.即刻移入到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
3
33.放進-70℃冰箱里保存
二、組織樣品
1. 手術(shù)取出動物組織,避免或去除脂肪組織,秤重以確定1 克組織重量(實驗前使動物空腹12 至
24 小時)
2. (選擇步驟)放進預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
3. (選擇步驟)加入xx 毫升清理液(Reagent A)清洗1 次
4. 即刻用刀片切碎組織
5. 放進一個預(yù)冷的15 毫升錐形離心管
6. 加入預(yù)冷的xx 毫升裂解液(Reagent B)
7. 渦旋震蕩5 秒,充分混勻
8. 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE 勻漿器
9. 在冰槽里用勻漿棒勻化組織(約20 至40 下)(注意:參見注意事項7)
10.將所有組織勻漿物移入15 毫升錐形離心管
11.放進4℃臺式離心機離心15 分鐘,速度為3000g
12.小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15 毫升錐形離心管——
13.放進-70℃冰箱里備用或放進冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
14.移取xx 毫升的分離液A(Reagent C)到8 毫升超速離心管
15.小心加入xx 毫升的分離液B(Reagent D)在分離液A(Reagent C)的上面,避免震動
16.輕輕加入xx 毫升上述高爾基體混勻液在分離液B(Reagent D)的上面,避免震動
17.放進4℃超速離心機離心4 小時,速度為100000g
18.小心取出超速離心管:可見樣品和分離液B(Reagent D)交界處棕色或乳黃色樣品帶
19.小心收集高爾基體樣品帶到8 毫升超速離心管(注意:用3 毫升針筒和18 號針頭,置于樣品帶下緣小
心緩慢抽吸)
20.加入xx 毫升保存液(Reagent E)
21.放進4℃超速離心機離心30 分鐘,速度為100000g
22.小心抽去上清液
23.加入xx 微升保存液(Reagent E),混勻
24.即刻移入到預(yù)冷的1.5 毫升離心管
25.放進-70℃冰箱里保存
注意事項
1. 本產(chǎn)品為10 次(1 克動物組織或5 X 107 細胞)操作
2. 操作時,須戴手套
3. 操作時,避免污染母液,尤其是裂解液(Reagent B)、分離液A/B(Reagent C/D)和保存液(Reagent
E)
4. 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進行
5. 建議使用足夠的樣品量
6. 建議嚴格控制操作時間
7. 通常勻化次數(shù)為20 至40 下(或細胞顆粒群/組織塊狀消失為止)達到80%的細胞裂解為理想狀態(tài),但
不同的組織或細胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3 微升勻漿物的細胞裂解程度:完整細
胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加勻化次數(shù)
4
8. 根據(jù)超速離心管的大小調(diào)整分離液A/B(Reagent C/D)的使用量或在樣品上面加上石蠟油填滿
9. 通常1 克動物組織的高爾基體含量為15 微克蛋白
10.本產(chǎn)品所獲得的高爾基體純度和產(chǎn)量zui為理想
11.高爾基體的標(biāo)志蛋白是UDP半乳糖轉(zhuǎn)移酶(UDP-glactosyl transferase);建議使用純化高爾基體UDP半
乳糖轉(zhuǎn)移酶(UDP-glactosyl transferase)活性比色法定量檢測試劑盒
12.本公司提供系列亞細胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的高爾基體維持正?;钚?br />3. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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