細(xì)菌蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量檢測試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)菌蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在通過底物偶氮酪蛋白受到蛋白酶水解，產(chǎn)生橘紅色產(chǎn)物的吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解液以及培養(yǎng)上清樣品蛋白酶的總活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

蛋白酶（protease）又稱為肽酶（peptidase）或蛋白質(zhì)酶（proteinase），是一類蛋白水解的酶，屬于水解酶（hydrolase）家屬中一員，存在于所有生物體內(nèi)。通過肽鍵的水解，進(jìn)行蛋白質(zhì)的分解代謝，參與體內(nèi)血液凝結(jié)、補(bǔ)體系統(tǒng)、凋亡、細(xì)胞生長和分化等一系列生理活動(dòng)。蛋白酶基本分成6類，包括絲氨酸（serine）、蘇氨酸（threonine）、半胱氨酸（cysteine）、谷氨酸（glutamate）、天冬氨酸（aspartate）、金屬（metalloprotease）蛋白酶等；也可以分成酸性、中性和堿性蛋白酶等；還可以分成內(nèi)切肽酶，例如胰蛋白酶（trypsin），和外切肽酶，例如羧基肽酶A（carboxypeptidase）。細(xì)菌蛋白酶與碳和氮循環(huán)有關(guān)；作為外毒素（exotoxin），也是細(xì)菌致病的毒力（virulence）因子；同時(shí)細(xì)菌蛋白酶可以應(yīng)用于食品、制藥、皮革、診斷、水處理、銀回收和潔凈劑工業(yè)等。 同時(shí)據(jù)此用以識(shí)別革藍(lán)氏陰性細(xì)菌，例如枯草芽孢桿菌（Bac. Subtilis）等?；诘孜锱嫉业鞍祝╝zocasein或sulfanilamide azocasein），在細(xì)菌蛋白酶的催化水解下，產(chǎn)生橘紅色產(chǎn)物，通過其吸收峰值的變化（440nm波長），來定量分析蛋白酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；終止液（Reagent C）和中和液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好500微升待測細(xì)菌（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 轉(zhuǎn)移到到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent A），充分混勻
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)菌裂解萃取液或培養(yǎng)上清等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長440nm，并置零

三、背景測定

• 移取xx微升 反應(yīng)液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx微升 終止液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒
• 在冰槽里孵育15分鐘
• 即刻放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為3000g 
• 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 中和液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到比色皿里
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照

• 樣品活性測定

• 移取xx微升 反應(yīng)液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管
• 加入100微升待測樣品（蛋白總量100微克）（注意：樣品需澄清）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx微升 終止液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒
• 在冰槽里孵育15分鐘
• 即刻放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為3000g 
• 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 中和液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到比色皿里
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)

• 計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
•  終止液（Reagent C）和 中和液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全
• 系統(tǒng)檢測時(shí)，背景測定只需一次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 比色測定后，比色皿須清洗*
• 建議待測樣本的蛋白濃度為100微克/100微升
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 蛋白酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）產(chǎn)生0.01吸光值的升高變化
• 本公司提供系列細(xì)菌生理生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感