細(xì)菌蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量檢測(cè)試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)菌蛋白酶（PROTEASE）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過底物偶氮酪蛋白受到蛋白酶水解，產(chǎn)生橘紅色產(chǎn)物的吸光峰值的變化，即采用比色法來測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心改良、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌細(xì)胞裂解液以及培養(yǎng)上清樣品蛋白酶的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

蛋白酶（protease）又稱為肽酶（peptidase）或蛋白質(zhì)酶（proteinase），是一類蛋白水解的酶，屬于水解酶（hydrolase）家屬中一員，存在于所有生物體內(nèi)。通過肽鍵的水解，進(jìn)行蛋白質(zhì)的分解代謝，參與體內(nèi)血液凝結(jié)、補(bǔ)體系統(tǒng)、凋亡、細(xì)胞生長(zhǎng)和分化等一系列生理活動(dòng)。蛋白酶基本分成6類，包括絲氨酸（serine）、蘇氨酸（threonine）、半胱氨酸（cysteine）、谷氨酸（glutamate）、天冬氨酸（aspartate）、金屬（metalloprotease）蛋白酶等；也可以分成酸性、中性和堿性蛋白酶等；還可以分成內(nèi)切肽酶，例如胰蛋白酶（trypsin），和外切肽酶，例如羧基肽酶A（carboxypeptidase）。細(xì)菌蛋白酶與碳和氮循環(huán)有關(guān)；作為外毒素（exotoxin），也是細(xì)菌致病的毒力（virulence）因子；同時(shí)細(xì)菌蛋白酶可以應(yīng)用于食品、制藥、皮革、診斷、水處理、銀回收和潔凈劑工業(yè)等。 同時(shí)據(jù)此用以識(shí)別革藍(lán)氏陰性細(xì)菌，例如枯草芽孢桿菌（Bac. Subtilis）等?；诘孜锱嫉业鞍祝╝zocasein或sulfanilamide azocasein），在細(xì)菌蛋白酶的催化水解下，產(chǎn)生橘紅色產(chǎn)物，通過其吸收峰值的變化（440nm波長(zhǎng)），來定量分析蛋白酶的總活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存反應(yīng)液（Reagent B）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；終止液（Reagent C）和中和液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

微型臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好500微升待測(cè)細(xì)菌（OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 轉(zhuǎn)移到到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g（或3500RPM，例如EPPENDORF 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent A），充分混勻
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里15分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)菌裂解萃取液或培養(yǎng)上清等），置于冰槽里
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為37℃）：波長(zhǎng)440nm，并置零

三、背景測(cè)定

• 移取xx微升 反應(yīng)液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 陰性液（Reagent E）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx微升 終止液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒
• 在冰槽里孵育15分鐘
• 即刻放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為3000g 
• 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 中和液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到比色皿里
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照

• 樣品活性測(cè)定

• 移取xx微升 反應(yīng)液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管
• 加入100微升待測(cè)樣品（蛋白總量100微克）（注意：樣品需澄清）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育30分鐘
• 加入xx微升 終止液（Reagent C）
• 渦旋震蕩5秒
• 在冰槽里孵育15分鐘
• 即刻放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘，速度為3000g 
• 小心移取500微升上清液到新的1.5毫升離心管
• 加入xx微升 中和液（Reagent D），混勻
• 轉(zhuǎn)移到比色皿里
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)

• 計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
•  終止液（Reagent C）和 中和液（Reagent D）具有腐蝕性，注意操作安全
• 系統(tǒng)檢測(cè)時(shí)，背景測(cè)定只需一次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 建議待測(cè)樣本的蛋白濃度為100微克/100微升
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 蛋白酶活性單位濃度定義：在37℃下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）產(chǎn)生0.01吸光值的升高變化
• 本公司提供系列細(xì)菌生理生化檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感