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上海宸功生物技術(shù)有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第10年

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植物葉片高質(zhì)純化葉綠體分離試劑盒

時(shí)間:2017/1/18閱讀:1349
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植物葉片高質(zhì)純化葉綠體分離試劑盒

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

 

主要用途

 

植物葉片高質(zhì)純化葉綠體分離試劑是一種旨在通過(guò)物理破壁和化學(xué)破膜,以及差速和等密度離心處理方法,從植物葉片組織中分離出完整而高度純化的活性葉綠體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適合于菠菜、豌豆、萵苣、卷心菜、甜菜、煙草等各種新鮮植物葉片(leaf)組織,同時(shí)也適用于植物谷粒grain)、種子(seed)等高純葉綠體成分的分離。用于高等植物不育性、葉綠體功能和活性、遺傳等研究。 產(chǎn)品即到即用,操作簡(jiǎn)易,性能穩(wěn)定,無(wú)核酶和蛋白酶污染,萃取純度和產(chǎn)量皆高。 

 

技術(shù)背景

 

葉綠體(chloroplast)是綠色植物進(jìn)行光合作用和能量轉(zhuǎn)化的重要細(xì)胞器。葉綠體是細(xì)胞質(zhì)中的一種色素體,因含葉綠素而成綠色。葉綠體由外被(envelope)、類囊體(thylakoid)和基質(zhì)(stroma)組成。葉綠體DNA是一種閉合環(huán)狀雙股結(jié)構(gòu),含有10至30個(gè)基因,編碼200個(gè)蛋白質(zhì)。  

 

產(chǎn)品內(nèi)容

 

清理液(Reagent A)

毫升

裂解液(Reagent B)

毫升

凈化液(Reagent C)

毫升

活性液(Reagent D)

毫升

強(qiáng)化液(Reagent E)

毫升

保存液(Reagent F)

毫升

高純液(Reagent G)

毫升

分離液(Reagent H)

毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

1份

 

保存方式

 

保存凈化液(Reagent C)活性液(Reagent D)在-20℃冰箱里,其余的保存在4冰箱里,有效保證6

 

用戶自備

 

15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于保存葉綠體樣品

尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng):用于去除植物裂解殘?jiān)?/span>

小型漏斗:用于過(guò)濾的裝置

(微型)臺(tái)式離心機(jī):用于樣品操作

DOUNCE勻漿器:用于裂解組織細(xì)胞

渦旋震蕩儀:用于混勻

 

實(shí)驗(yàn)步驟

 

  • 物理勻漿法

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C活性液(Reagent D凍融,然后移取xx微升活性液(Reagent D、 xx毫升凈化液(Reagent Cxx毫升的裂解液(Reagent B15毫升錐形離心管里,混勻后,標(biāo)記為裂解工作液,置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 準(zhǔn)備好新鮮的植物葉片組織,并秤重以確定1克組織重量 
  • (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入xx毫升清理液(Reagent A清洗1
  • 用刀片切碎組織(注意:建議去除葉莖)
  • 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
  • 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
  • 置于冰槽里用勻漿棒勻化組織(約80下)(注意:參見(jiàn)注意事項(xiàng)9
  • (選擇步驟)準(zhǔn)備1個(gè)小型漏斗,內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng),置于50毫升錐形離心管上
  • (選擇步驟)將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過(guò)濾(注意:可以使用4層紗布替代)
  • 放進(jìn)4臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為200g
  • 小心移出上清液(注意:不要觸碰沉淀物)到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管(如果跳過(guò)過(guò)濾步驟或上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)貜?fù)離心5分鐘一次,速度為200g——此步驟去除細(xì)胞壁殘?jiān)?、?xì)胞核和未溶解的細(xì)胞 
  • 放進(jìn)4臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1000g
  • 小心抽去上清液,保留綠色沉淀顆粒,避免光照——此步驟獲得葉綠體沉淀物
  • 加入xx毫升保存液(Reagent F),混勻顆粒群
  • 放進(jìn)-70冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
  • 移取xx毫升的高純液(Reagent G15毫升錐形離心管
  • 小心沿著管壁,在高純液(Reagent G)上面,一滴一滴加入xx毫升分層液(Reagent H)(注意:避免晃動(dòng))
  • 小心沿著管壁,在分層液(Reagent H)上面,一滴一滴加入3毫升上述獲得的葉綠體組分 (注意:避免晃動(dòng))
  • 小心放進(jìn)4臺(tái)式離心機(jī)離心30分鐘,速度為2500g
  • 小心取出離心管(注意:避免晃動(dòng)):可見(jiàn)中間交界處(8厘米處)綠色樣品帶 
  • 小心抽去葉綠體樣品帶以上的液體
  • 小心收集葉綠體樣品帶到2毫升離心管——此步驟獲得高純葉綠體樣品帶
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘,速度為1500g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升保存液(Reagent F),充分混勻沉淀顆粒群
  • (選擇步驟)進(jìn)行葉綠素定量測(cè)定(建議使用植物葉綠體總蛋白定量檢測(cè)試劑盒)
  • 即刻移入1.5毫升離心管,放進(jìn)-70冰箱里保存

 

  • 化學(xué)處理法

 

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C活性液(Reagent D凍融,然后移取xx微升活性液(Reagent D、 xx毫升凈化液(Reagent Cxx毫升的裂解液(Reagent B15毫升錐形離心管里,混勻后,標(biāo)記為裂解工作液,置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

 

  • 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織(葉片、谷粒、種子等),并秤重以確定1克組織重量 
  • (選擇步驟)放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
  • (選擇步驟)加入xx毫升清理液(Reagent A)清洗1次
  • 移入一個(gè)液氮凍存管
  • 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
  • 次日從液氮罐里取出,即刻(zui快速度)碾碎組織成粉末(注意:切莫使組織凍融
  • 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
  • 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 在冰槽里孵育2分鐘,期間渦旋震蕩5秒一次
  • 加入預(yù)冷的xx微升強(qiáng)化液(Reagent E
  • 渦旋震蕩5秒,充分混勻
  • 在冰槽里孵育5分鐘,期間渦旋震蕩5秒二次(注意:參見(jiàn)注意事項(xiàng)10
  • 加入預(yù)冷的xx毫升保存液(Reagent F,輕輕搖動(dòng)試管混勻
  • (選擇步驟)準(zhǔn)備1個(gè)小型漏斗,內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng),置于50毫升錐形離心管上
  • (選擇步驟)將所有組織裂解液移入到小型漏斗里過(guò)濾(注意:可以使用4層紗布替代)
  • 放進(jìn)4臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘,速度為200g
  • 小心移出上清液(注意:不要觸碰沉淀物)到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管(如果如果跳過(guò)過(guò)濾步驟或上清液含有肉眼可見(jiàn)的殘?jiān)?,重?fù)離心5分鐘一次,速度為200g)——此步驟去除細(xì)胞壁殘?jiān)?、?xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
  • 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1000g
  • 小心抽去上清液,保留綠色沉淀顆粒,避免光照——此步驟獲得葉綠體沉淀物
  • 加入xx毫升保存液(Reagent F),混勻顆粒群
  • 放進(jìn)-70冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
  • 移取xx毫升的高純液(Reagent G15毫升錐形離心管
  • 小心沿著管壁,在高純液(Reagent G)上面,一滴一滴加入xx毫升分層液(Reagent H)(注意:避免晃動(dòng))
  • 小心沿著管壁,在分層液(Reagent H)上面,一滴一滴加入3毫升上述獲得的葉綠體組分 (注意:避免晃動(dòng))
  • 小心放進(jìn)4臺(tái)式離心機(jī)離心30分鐘,速度為2500g
  • 小心取出離心管(注意:避免晃動(dòng)):可見(jiàn)中間交界處(8厘米處)綠色樣品帶 
  • 小心抽去葉綠體樣品帶以上的液體
  • 小心收集葉綠體樣品帶到2毫升離心管——此步驟獲得高純葉綠體樣品帶
  • 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心15分鐘,速度為1500g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微升保存液(Reagent F),充分混勻沉淀顆粒群
  • (選擇步驟)進(jìn)行葉綠素定量測(cè)定(建議使用植物葉綠體總蛋白定量檢測(cè)試劑盒)
  • 即刻移入1.5毫升離心管,放進(jìn)-70冰箱里保存

 

注意事項(xiàng)

 

  • 本產(chǎn)品為10次操作(1克植物葉片組織/次
  • 建議使用新鮮植物樣品,暗室4冰箱里過(guò)夜
  • 植物樣品務(wù)必避光,以防止淀粉聚集
  • 葉綠體操作均須在4或以下?tīng)顟B(tài)下進(jìn)行
  • 操作時(shí),須無(wú)菌操作,避免污染母液,尤其是裂解液(Reagent B)、保存液(Reagent F、高純液(Reagent G)和分離液(Reagent H)
  • 建議使用足夠的組織量
  • 建議植物組織使用物理法組織勻漿器操作為;德國(guó)的BRAUN細(xì)胞勻漿器zui為理想
  • 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
  • 通常勻化次數(shù)為80(或組織塊狀消失為止達(dá)到80%的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài),但不同的組織類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的組織細(xì)胞裂解程度:完整組織細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加勻化次數(shù)
  • 通常孵育5分鐘達(dá)到80%的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài),但不同的組織類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升裂解物的組織細(xì)胞裂解程度:完整組織細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
  • 本公司提供系列植物葉綠體分析技術(shù)產(chǎn)品

 

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

 

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的葉綠體內(nèi)外膜完整
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的葉綠體維持正?;钚?/span>
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶

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