植物葉片高質(zhì)純化葉綠體分離試劑盒

產(chǎn)品說明書

主要用途

植物葉片高質(zhì)純化葉綠體分離試劑是一種旨在通過物理破壁和化學(xué)破膜，以及差速和等密度離心處理方法，從植物葉片組織中分離出完整而高度純化的活性葉綠體細(xì)胞器的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于菠菜、豌豆、萵苣、卷心菜、甜菜、煙草等各種新鮮植物葉片（leaf）組織，同時也適用于植物谷粒（grain）、種子（seed）等高純葉綠體成分的分離。用于高等植物不育性、葉綠體功能和活性、遺傳等研究。 產(chǎn)品即到即用，操作簡易，性能穩(wěn)定，無核酶和蛋白酶污染，萃取純度和產(chǎn)量皆高。 

技術(shù)背景

葉綠體（chloroplast）是綠色植物進(jìn)行光合作用和能量轉(zhuǎn)化的重要細(xì)胞器。葉綠體是細(xì)胞質(zhì)中的一種色素體，因含葉綠素而成綠色。葉綠體由外被（envelope）、類囊體（thylakoid）和基質(zhì)（stroma）組成。葉綠體DNA是一種閉合環(huán)狀雙股結(jié)構(gòu)，含有10至30個基因，編碼200個蛋白質(zhì)。  

產(chǎn)品內(nèi)容

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于保存葉綠體樣品

尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)：用于去除植物裂解殘渣

小型漏斗：用于過濾的裝置

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織細(xì)胞

渦旋震蕩儀：用于混勻

實驗步驟

• 物理勻漿法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移取xx微升活性液（Reagent D）、 xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物葉片組織，并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 用刀片切碎組織（注意：建議去除葉莖）
• 放進(jìn)一個預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 置于冰槽里用勻漿棒勻化組織（約80下）（注意：參見注意事項9）
• （選擇步驟）準(zhǔn)備1個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
• （選擇步驟）將所有組織勻漿液移入到小型漏斗里過濾（注意：可以使用4層紗布替代）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為200g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果跳過過濾步驟或上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為200g）——此步驟去除細(xì)胞壁殘渣、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞 

• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液，保留綠色沉淀顆粒，避免光照——此步驟獲得葉綠體沉淀物
• 加入xx毫升保存液（Reagent F），混勻顆粒群
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取xx毫升的高純液（Reagent G）到15毫升錐形離心管
• 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入xx毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）
• 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入3毫升上述獲得的葉綠體組分 （注意：避免晃動）
• 小心放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心30分鐘，速度為2500g
• 小心取出離心管（注意：避免晃動）：可見中間交界處（8厘米處）綠色樣品帶 
• 小心抽去葉綠體樣品帶以上的液體
• 小心收集葉綠體樣品帶到2毫升離心管——此步驟獲得高純葉綠體樣品帶
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒群
• （選擇步驟）進(jìn)行葉綠素定量測定（建議使用植物葉綠體總蛋白定量檢測試劑盒）
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里保存

• 化學(xué)處理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移取xx微升活性液（Reagent D）、 xx毫升凈化液（Reagent C）和xx毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，置入冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定1克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的50毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入一個液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）碾碎組織成粉末（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的xx毫升裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入預(yù)冷的xx微升強(qiáng)化液（Reagent E）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項10）
• 加入預(yù)冷的xx毫升保存液（Reagent F），輕輕搖動試管混勻
• （選擇步驟）準(zhǔn)備1個小型漏斗，內(nèi)襯尼龍絲或60微米尼龍網(wǎng)，置于50毫升錐形離心管上
• （選擇步驟）將所有組織裂解液移入到小型漏斗里過濾（注意：可以使用4層紗布替代）
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為200g
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管（如果如果跳過過濾步驟或上清液含有肉眼可見的殘渣，重復(fù)離心5分鐘一次，速度為200g）——此步驟去除細(xì)胞壁殘渣、細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g
• 小心抽去上清液，保留綠色沉淀顆粒，避免光照——此步驟獲得葉綠體沉淀物

• 加入xx毫升保存液（Reagent F），混勻顆粒群
• 放進(jìn)－70℃冰箱里備用或放進(jìn)冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
• 移取xx毫升的高純液（Reagent G）到15毫升錐形離心管
• 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入xx毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）
• 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入3毫升上述獲得的葉綠體組分 （注意：避免晃動）
• 小心放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心30分鐘，速度為2500g
• 小心取出離心管（注意：避免晃動）：可見中間交界處（8厘米處）綠色樣品帶 
• 小心抽去葉綠體樣品帶以上的液體
• 小心收集葉綠體樣品帶到2毫升離心管——此步驟獲得高純葉綠體樣品帶
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為1500g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀顆粒群
• （選擇步驟）進(jìn)行葉綠素定量測定（建議使用植物葉綠體總蛋白定量檢測試劑盒）
• 即刻移入1.5毫升離心管，放進(jìn)－70℃冰箱里保存

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次操作（1克植物葉片組織/次）
• 建議使用新鮮植物樣品，暗室4℃冰箱里過夜
• 植物樣品務(wù)必避光，以防止淀粉聚集
• 葉綠體操作均須在4℃或以下狀態(tài)下進(jìn)行
• 操作時，須無菌操作，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）、保存液（Reagent F）、高純液（Reagent G）和分離液（Reagent H）
• 建議使用足夠的組織量
• 建議植物組織使用物理法組織勻漿器操作為；德國的BRAUN細(xì)胞勻漿器zui為理想
• 建議嚴(yán)格控制操作時間
• 通常勻化次數(shù)為80下（或組織塊狀消失為止）達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的組織細(xì)胞裂解程度：完整組織細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的組織細(xì)胞裂解程度：完整組織細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)
• 本公司提供系列植物葉綠體分析技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的葉綠體內(nèi)外膜完整
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的葉綠體維持正常活性
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶