ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)原理

1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)用于IgG定量測(cè)定的文章，使得1966年開(kāi)始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測(cè)定方法。

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度

類(lèi)型及步驟

ELISA的主要常用類(lèi)型及步驟

1. 間接法測(cè)抗體

間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(二抗)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱(chēng)為間接法。操作步驟如下：

1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原，洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

2)加稀釋的樣本，保溫反應(yīng)。樣本中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，樣本中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。

3)加酶標(biāo)抗抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢抗體的量正相關(guān)。

4)加底物顯色。

2.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原

小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，zui后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。

如何選擇合適的陽(yáng)性對(duì)照?

陽(yáng)性對(duì)照的基本組成應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致，一般陽(yáng)性對(duì)照多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，加入一定量的待檢物質(zhì)。比如，以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，陽(yáng)性對(duì)照多用確定的病人血清或者以復(fù)鈣人血漿為原料加入一定量標(biāo)準(zhǔn)品。

如何選擇合適的陰性對(duì)照?

陰性對(duì)照的基本組成也應(yīng)該盡量與檢測(cè)樣本的組成一致，先行檢測(cè)確定其中不含待檢物質(zhì)。比如，檢測(cè)人血清標(biāo)本時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)該選擇正常人血清;檢測(cè)免疫動(dòng)物血清中抗體效價(jià)時(shí)，陰性對(duì)照應(yīng)該選擇該動(dòng)物的免疫前血清。

如何選擇*化的包被條件?

1.包被抗原的選擇

包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原三大類(lèi)。天然蛋白需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對(duì)于含雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被(先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上，再通過(guò)特異性反應(yīng)使抗原固相化)。經(jīng)純化的重組蛋白一般皆可直接包板。小分子抗原比如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物，由于分子量太小，往往難于直接吸附在酶標(biāo)板上，一般都先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如BSA等偶聯(lián)，偶聯(lián)物吸附于固相載體上。

2.包被液的選擇

一般常用的是pH9.6的碳酸鹽緩沖液，如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話(huà)，也可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

3.包被溫度的選擇

通常是4-8度條件下過(guò)一夜或者37度保溫2小時(shí)，我們強(qiáng)烈建議4-8度條件下包被，有利于蛋白活性的保持。

4.包被濃度的選擇

包被的zui適濃度隨固相載體和包被物的性質(zhì)變化，一般蛋白質(zhì)的包被濃度為1-5ug/ml，要明確針對(duì)特定包被抗原的zui適包被濃度需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。

包板后需要封閉嗎?應(yīng)該選擇什么樣的封閉體系?

封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿(mǎn)意的結(jié)果。而在間接法測(cè)定中，封閉一般是*的。

常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉，AbMART推薦使用5%脫脂奶粉，價(jià)廉而且封閉能力強(qiáng)，不過(guò)5%脫脂奶粉只適合短期內(nèi)使用，不宜保存，所以試劑盒中較少使用。

如何正確使用酶結(jié)合物?

1.酶結(jié)合物的稀釋液

在稀釋液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)(例如1%BSA或5%脫脂奶粉)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制酶結(jié)合物在固相載體上的非特異性吸附。一般還加入能夠抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20(0.05%的濃度較為適宜)。

2.正確稀釋酶結(jié)合物

酶結(jié)合物的合適工作濃度需要通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，濃度過(guò)高易導(dǎo)致本底偏高，濃度過(guò)低則會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性信號(hào)的減弱。

酶結(jié)合物在使用前稀釋?zhuān)♂尯蟮拿附Y(jié)合物不宜保存，因?yàn)榈蜐舛鹊拿附Y(jié)合物極易失活。

問(wèn)題/可能的原因/解決方法

1、問(wèn)題：陰性對(duì)照產(chǎn)生了陽(yáng)性的結(jié)果

  可能的原因：試劑或者耗材污染

  解決方法：更換試劑，使用一次性耗材

2、問(wèn)題：洗板出現(xiàn)問(wèn)題

  解決方法：更換更強(qiáng)配方的洗滌液，增加洗板次數(shù)，延長(zhǎng)洗板時(shí)間

  （如果是在雙抗體夾心法中出現(xiàn)，有可能是包被抗體與二抗間有交叉反應(yīng)，則要更換包被抗體或二抗）

3、問(wèn)題：二抗產(chǎn)生了非特異性吸附

  解決方法：減少二抗使用量，縮短二抗反應(yīng)時(shí)間

4、問(wèn)題：顯色液不新鮮

  解決方法：使用現(xiàn)配的顯色液

5、問(wèn)題：反應(yīng)信號(hào)偏低

  可能的原因：包被條件不合適

  解決方法：提高包板濃度，延長(zhǎng)包板時(shí)間

6、問(wèn)題：梯度稀釋做ELISA時(shí)產(chǎn)生跳孔現(xiàn)象

  可能的原因：酶標(biāo)板疊放導(dǎo)致傳熱不均勻，各孔反應(yīng)溫度有差異

  解決方法：盡量避免酶標(biāo)板疊放在一起

7、問(wèn)題：移液器稀釋時(shí)未能保持連續(xù)性

  解決方法：定期校準(zhǔn)移液器，確保移液器的正確使用