18017.1 v.A

細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)

主要用途

細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)乙氧基異吩噁唑脫乙基酶反應(yīng)系統(tǒng)中乙氧基異吩噁唑轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮后熒光峰值的變化，即采用熒光法來(lái)測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞或組織裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）或純化微粒體樣品細(xì)胞色素P450亞酶1A1的總活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

細(xì)胞色素P450亞酶1A1，簡(jiǎn)稱(chēng)為CYP1A1，又稱(chēng)芳香族碳?xì)浠衔锛恿u基酶（aryl hydrocarbon hydrorylase；AHH）是肝細(xì)胞微粒體復(fù)合功能氧化酶系統(tǒng)的成員之一。CYP1A1由三個(gè)亞型：M1、M2、M3。其作用在于體內(nèi)外源化合物（xenobiotics），包括藥物、致癌劑、化學(xué)污染物的氧化代謝，即單加氧化作用（monooxygenation）和羥化作用（hydroxylation）。芳香族碳?xì)浠衔镎T導(dǎo)CYP1A1的表達(dá)。乙氧基異吩噁唑脫乙基酶（7-ethoxyresorufin O-deacylase；EROD）的活性是細(xì)胞色素P450亞酶1A1的診斷標(biāo)記，其基于EROD選擇性催化細(xì)胞色素P450亞酶1A1的活性。乙氧基異吩噁唑（7-ethoxyresorufin）在乙氧基異吩噁唑脫乙基酶的催化下，轉(zhuǎn)化為羥基異吩噁唑酮（resorufin）后熒光峰值的變化（激發(fā)波長(zhǎng)530nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm），來(lái)定量測(cè)定細(xì)胞色素P450亞酶1A1的活性。乙氧基異吩噁唑脫乙基酶反應(yīng)系統(tǒng)為：

          EROD

7－ethoxyresorufin  +  NADPH       →      resorufin  +  NADP⁺

產(chǎn)品內(nèi)容

緩沖液（Reagent A） 25毫升

反應(yīng)液（Reagent B） 2.5毫升

底物液（Reagent C）     500微升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）      50微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，底物液（Reagent C）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）避免光照，有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制的容器

恒溫水槽：用于孵育反應(yīng)

比色皿或黑色96孔板：用于熒光分析的容器

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或微粒體樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光分光光度儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)530nm，散發(fā)波長(zhǎng)590nm，增益倍數(shù)100 
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 加入180微升緩沖液（Reagent A）到1號(hào)管
• 分別加入100微升緩沖液（Reagent A）到2至5號(hào)管
• 移取20微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取100微升1號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取100微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取100微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent D）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定

• 移取780微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升底物液（Reagent C）
• 加入100微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至7四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位（RFU）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

• 樣品測(cè)定

• 移取780微升緩沖液（Reagent A）到新的比色皿
• 加入100微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 加入20微升底物液（Reagent C）
• 加入100微升待測(cè)樣品（20微克微粒體蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 上下傾倒數(shù)次，混勻
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：獲得樣品相對(duì)熒光單位（Relative Fluorescence Unit；RFU）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）

• 計(jì)算樣品實(shí)際活性

[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ 10（分鐘）＝皮摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

• 熒光酶標(biāo)儀測(cè)定

• 在黑色96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品
• 分別移取195微升緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔里
• 分別加入25微升反應(yīng)液（Reagent B）
• 分別加入5微升底物液（Reagent C）
• 分別加入25微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20微克微粒體蛋白或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光單位
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）
• 樣品實(shí)際活性計(jì)算：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)獲得樣品對(duì)應(yīng)羥基異吩噁唑酮濃度（納摩爾/升）X樣品稀釋倍數(shù)]÷ 10（分鐘）＝皮摩爾/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝皮摩爾/毫克/分鐘

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次（比色皿）或85次（黑色96孔板）操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過(guò)程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要（本公司提供細(xì)胞可溶性總蛋白質(zhì)制備試劑盒30002.1）
• 熒光檢測(cè)易受到蛋白的干擾，例如牛血清白蛋白（bovine serum albumin；BSA）會(huì)與羥基異吩噁唑酮（resorufin）結(jié)合，導(dǎo)致熒光讀數(shù)的降低
• 如果樣品讀數(shù)低于背景讀數(shù)明顯，建議使用失活的樣品作為樣品背景對(duì)照，以及標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測(cè)定
• 如果酶活性過(guò)低，可以增加反應(yīng)時(shí)間至30分鐘
• 熒光測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 如果檢測(cè)血液樣品，建議使用體外非細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性熒光定量檢測(cè)試劑盒——18017.2
• 建議待測(cè)樣本為微粒體，其蛋白濃度為20微克/100微升；待測(cè)樣本為細(xì)胞裂解懸液，其蛋白濃度為100至200微克/100微升（本公司提供  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過(guò)高或過(guò)低，可以調(diào)整樣品濃度
• 用戶(hù)可以使用CYP1A1選擇性抑制劑α-萘黃酮（α-Naphthoflavone）作為陰性對(duì)照或抑制劑對(duì)照
• 通常人體細(xì)胞微粒體細(xì)胞色素P450亞酶1A1活性濃度為：0.25±0.1皮摩爾/分鐘/毫克蛋白
• 細(xì)胞色素P450亞酶1A1單位活性定義為：在37℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1納摩爾乙氧基異吩噁唑至羥基異吩噁唑酮所需的酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列毒理學(xué)檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感

使用承諾

本公司秉著“信譽(yù)至上、客戶(hù)滿(mǎn)意、質(zhì)量承諾”的宗旨為我們的用戶(hù)提供產(chǎn)品和服務(wù)。用戶(hù)收到貨后，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上的規(guī)定妥善保管并在有效期內(nèi)使用。我們的產(chǎn)品在銷(xiāo)售前已作嚴(yán)格的質(zhì)量鑒定，保證說(shuō)明書(shū)所述的使用效果。在貨到后10天內(nèi)若發(fā)現(xiàn)確屬本產(chǎn)品的質(zhì)量問(wèn)題，請(qǐng)立即以書(shū)面形式（實(shí)驗(yàn)報(bào)告），并將該產(chǎn)品退回，經(jīng)檢驗(yàn)確系產(chǎn)品質(zhì)量所致，本公司負(fù)責(zé)更換產(chǎn)品。如系使用者錯(cuò)誤操作所致，本公司不承擔(dān)由此造成的損失。