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主要用途
動(dòng)物細(xì)胞高純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑是一種旨在通過(guò)機(jī)械或化學(xué)處理、差速和等密度離心方法,從動(dòng)物細(xì)胞中分離出活性完整而高度純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器組分的較好而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其制備物產(chǎn)量高,活性保證,純度可達(dá)99%。適合于各種動(dòng)物原代和培養(yǎng)細(xì)胞(人體、老鼠、兔子等)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的制備??梢员挥糜诩?xì)胞色素P450系統(tǒng)外源化合物(xenobiotics)代謝、脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白和腔內(nèi)蛋白等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶,即到即用,性能穩(wěn)定,分離產(chǎn)量高。
技術(shù)背景
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum;ER)是真核生物的細(xì)胞器組分,構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)小管(tubules)、囊泡(vesicles)和小池(cisternae/sac)相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),負(fù)責(zé)蛋白轉(zhuǎn)譯、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)成為細(xì)胞膜成分(例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等)或分泌型蛋白(例如消化性酶),負(fù)責(zé)鈣離子區(qū)隔(sequestration),以及糖原、固醇類和其它大分子的生產(chǎn)和儲(chǔ)存等功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分成三種:粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Rough endoplasmic reticulum;RER)、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Smooth endoplasmic reticulum;SER)和肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum;SR)。根據(jù)細(xì)胞代謝的需要,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)互相轉(zhuǎn)換。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)核糖體合成蛋白質(zhì)并分類;滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行固醇、碳水化合物和藥物代謝等。肌質(zhì)網(wǎng)的主要功能為儲(chǔ)存和釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一:第一,通過(guò)機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞;第二,通過(guò)低速差速離心去除殘?jiān)樾己途薮蠹?xì)胞器;第三,通過(guò)高速差速離心獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng);甚至,第四,可以通過(guò)等密度離心獲得純度更高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
產(chǎn)品內(nèi)容
清理液(Reagent A) 100毫升
裂解液(Reagent B) 100毫升
凈化液(Reagent C) 10毫升
活性液(Reagent D) 100微升
強(qiáng)化液(Reagent E) 5毫升
保存液(Reagent F) 50毫升
高純液(Reagent G) 25毫升
分層液(Reagent H) 25毫升
產(chǎn)品說(shuō)明書(shū) 1份
保存方式
保存凈化液(Reagent C)和活性液(Reagent D)在-20℃冰箱里,其余的保存在4℃冰箱里,有效保證6月
用戶自備
HANK平衡鹽緩沖溶液(12028)或PBS緩沖溶液(12033):用于清理細(xì)胞
YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液(12024):用于細(xì)胞脫離
*細(xì)胞培養(yǎng)液(12052):用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基
50毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
15毫升錐形離心管:用于樣品制備的容器
1.5毫升離心管:用于樣品操作的容器
6毫升超速離心管:用于超高速離心的容器
4℃臺(tái)式離心機(jī):用于樣品制備
4℃超速離心機(jī):用于樣品制備
DOUNCE勻漿器:用于裂解組織
試管固定支架:用于離心管固定支撐
3號(hào)針筒和18號(hào)針頭:用于收集樣品
實(shí)驗(yàn)步驟
一、 組織勻漿法
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C)和活性液(Reagent D)凍融,然后移出移取10微升活性液(Reagent D)、 1毫升凈化液(Reagent C)到4毫升的裂解液(Reagent B)里,混勻后,置入冰槽里,標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。
1. 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞(5 X 107),直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2. 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,覆蓋培養(yǎng)瓶表面,然后抽去
3. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
4. 加入3毫升用戶自備的YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
5. 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6. 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫落,
7. 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
8. 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
9. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為200g
10. 小心抽去上清液
11. 加入10毫升預(yù)冷的清理液(Reagent A),混勻細(xì)胞
12. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為300g
13. 小心抽去上清液
14. 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
15. 渦旋震蕩5秒,充分混勻細(xì)胞顆粒群
16. 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
17. 在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞(約20至40下)(注意:參見(jiàn)注意事項(xiàng)7)
18. 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
19. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1000g
20. 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解細(xì)胞
21. 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心15分鐘,速度為12000g
22. 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分(post mitochondrialfraction;PMF)
23. 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘,速度為100000g
24. 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分
25. 即刻加入500微升保存液(Reagent F),充分混勻沉淀物
26. 置于冰槽里備用
27. 準(zhǔn)備1個(gè)6毫升超速離心管
28. 加入2.5毫升高純液(Reagent G)
29. 小心沿著管壁,在高純液(Reagent G)上面,一滴一滴加入2.5毫升分層液(Reagent H)(注意:避免晃動(dòng))
30. 小心沿著管壁,在分層液(Reagent H)上面,一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分(注意:避免晃動(dòng))
31. 小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心30分鐘,速度為130000g
32. 小心取出超速離心管:可見(jiàn)上端三分之一處(滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng))和下端三分之一處(粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng))棕色或乳黃色樣品帶
33. 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體
34. 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管(注意:用3毫升針筒和18號(hào)針頭,置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸)——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品
35. 進(jìn)一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體
36. 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個(gè)2毫升離心管(注意:用3毫升針筒和18號(hào)針頭,置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸)——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品
37. 分別加入1至2毫升保存液(Reagent F)
38. 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘,速度為100000g
39. 小心抽去上清液
40. 分別加入500微升保存液(Reagent F),混勻
41. 放進(jìn)-70℃冰箱里保存
二、 化學(xué)處理法
實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前,將試劑盒里的凈化液(Reagent C)和活性液(Reagent D)凍融,然后移出移取10微升活性液(Reagent D)、1毫升凈化液(Reagent C)到4毫升的裂解液(Reagent B)里,混勻后,置入冰槽里,標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。
1. 準(zhǔn)備5至10瓶75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞(5 X 107),直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
2. 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶,覆蓋培養(yǎng)瓶表面,然后抽去
3. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2一次
4. 加入3毫升用戶自備的YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液,鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
5. 置入37℃培養(yǎng)箱3分種
6. 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶,使細(xì)胞脫落
7. 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
8. 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
9. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為200g
10. 小心抽去上清液
11. 加入10毫升預(yù)冷的清理液(Reagent A)
12. 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為300g
13. 小心抽去上清液
14. 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
15. 渦旋震蕩5秒,充分混勻
16. 在冰槽里孵育2分鐘,期間渦旋震蕩5秒一次
17. 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液(Reagent D)
18. 渦旋震蕩5秒,充分混勻
19. 在冰槽里孵育5分鐘,期間渦旋震蕩5秒二次(注意:參見(jiàn)注意事項(xiàng)8)
20. 加入5毫升預(yù)冷的裂解液(Reagent B),輕輕搖動(dòng)試管混勻
21. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘,速度為1000g
22. 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解細(xì)胞
23. 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘,速度為12000g
24. 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得線粒體組分(post mitochondrialfraction;PMF)
25. 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘,速度為100000g
26. 小心抽去上清液,保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分
27. 即刻加入500微升保存液(Reagent F),充分混勻沉淀物
28. 置于冰槽里備用
29. 準(zhǔn)備1個(gè)6毫升超速離心管
30. 加入2.5毫升高純液(Reagent G)
31. 小心沿著管壁,在高純液(Reagent G)上面,一滴一滴加入2.5毫升分層液(Reagent H)(注意:避免晃動(dòng))
32. 小心沿著管壁,在分層液(Reagent H)上面,一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分(注意:避免晃動(dòng))
33. 小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心30分鐘,速度為130000g
34. 小心取出超速離心管:可見(jiàn)上端三分之一處(滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng))和下端三分之一處(粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng))棕色或乳黃色樣品帶
35. 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體
36. 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管(注意:用3毫升針筒和18號(hào)針頭,置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸)——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品
37. 進(jìn)一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體
38. 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個(gè)2毫升離心管(注意:用3毫升針筒和18號(hào)針頭,置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸)——此步驟獲得高純粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品
39. 分別加入1至2毫升保存液(Reagent F)
40. 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘,速度為100000g
41. 小心抽去上清液
42. 分別加入500微升保存液(Reagent F),混勻
43. 放進(jìn)-70℃冰箱里保存
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品為10次(5 X 107動(dòng)物細(xì)胞)操作
2. 操作時(shí),須戴手套
3. 操作時(shí),避免污染母液,尤其是裂解液(Reagent B)和保存液(Reagent F)
4. 所有操作均須在4℃或以下?tīng)顟B(tài)進(jìn)行
5. 建議使用足夠的樣品量
6. 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
7. 通常勻化次數(shù)為20至40下(或細(xì)胞顆粒群消失為止)達(dá)到80%的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài),但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度:完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加勻化次數(shù)
8. 通常孵育5分鐘(不宜超過(guò)5分鐘)達(dá)到80%的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài),但不同的細(xì)胞類型會(huì)存在差異。用戶可以通過(guò)顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度:完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50%可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
9. 對(duì)于難以裂解的細(xì)胞,例如HeLa細(xì)胞,采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
10. 腦組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉淀顆粒非常松動(dòng),注意操作損失
11. 通常5 X 107動(dòng)物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量為500至1000微克蛋白
12. 本產(chǎn)品所獲得的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)純度達(dá)95%以上
13. 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志蛋白是NADPHXIBAOSESUC還原酶(NADPH Cytochrome C Reductase);建議使用 組織NADPHXIBAOSESUC還原酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒-50303.2
14. 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志是核糖體RNA(ribosome RNA);建議使用 RNA熒光(RiboGreen)定量檢測(cè)試劑盒——20129
15. 本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持正?;钚?/span>
3. 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶
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