主要用途

動物細(xì)胞高純內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離試劑是一種旨在通過機(jī)械或化學(xué)處理、差速和等密度離心方法，從動物細(xì)胞中分離出活性完整而高度純化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器組分的較好而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其制備物產(chǎn)量高，活性保證，純度可達(dá)99％。適合于各種動物原代和培養(yǎng)細(xì)胞（人體、老鼠、兔子等）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的制備?？梢员挥糜诩?xì)胞色素P450系統(tǒng)外源化合物（xenobiotics）代謝、脂類代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白和腔內(nèi)蛋白等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶和核酶，即到即用，性能穩(wěn)定，分離產(chǎn)量高。

技術(shù)背景

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum；ER）是真核生物的細(xì)胞器組分，構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)小管（tubules）、囊泡（vesicles）和小池（cisternae/sac）相互連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，負(fù)責(zé)蛋白轉(zhuǎn)譯、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)成為細(xì)胞膜成分（例如跨膜受體和其它整合膜蛋白等）或分泌型蛋白（例如消化性酶），負(fù)責(zé)鈣離子區(qū)隔（sequestration），以及糖原、固醇類和其它大分子的生產(chǎn)和儲存等功能。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分成三種：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Rough endoplasmic reticulum；RER）、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Smooth endoplasmic reticulum；SER）和肌質(zhì)網(wǎng)（sarcoplasmic reticulum；SR）。根據(jù)細(xì)胞代謝的需要，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會互相轉(zhuǎn)換。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過核糖體合成蛋白質(zhì)并分類；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行固醇、碳水化合物和藥物代謝等。肌質(zhì)網(wǎng)的主要功能為儲存和釋放鈣離子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分離是現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)研究的常用手段之一：第一，通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂組織細(xì)胞；第二，通過低速差速離心去除殘渣碎屑和巨大細(xì)胞器；第三，通過高速差速離心獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；甚至，第四，可以通過等密度離心獲得純度更高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）        100毫升

裂解液（Reagent B）        100毫升

凈化液（Reagent C）        10毫升

活性液（Reagent D）        100微升

強(qiáng)化液（Reagent E）        5毫升

保存液（Reagent F）        50毫升

高純液（Reagent G）        25毫升

分層液（Reagent H）        25毫升

產(chǎn)品說明書           1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細(xì)胞

YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

50毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作的容器

6毫升超速離心管：用于超高速離心的容器

4℃臺式離心機(jī)：用于樣品制備

4℃超速離心機(jī)：用于樣品制備

DOUNCE勻漿器：用于裂解組織

試管固定支架：用于離心管固定支撐

3號針筒和18號針頭：用于收集樣品

實驗步驟

一、 組織勻漿法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、 1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去

3． 重復(fù)實驗步驟2一次

4． 加入3毫升用戶自備的YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面

5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種

6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落，

7． 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 移入一個50毫升錐形離心管

9． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

12． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液

15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群

16． 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器

17． 在冰槽里用勻漿幫勻化細(xì)胞（約20至40下）（注意：參見注意事項7）

18． 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管

19． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g

20． 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解細(xì)胞

21． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心15分鐘，速度為12000g

22． 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得后線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF）

23． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g

24． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分

25． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物

26． 置于冰槽里備用

27． 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管

28． 加入2.5毫升高純液（Reagent G）

29． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）

30． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（注意：避免晃動）

31． 小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心30分鐘，速度為130000g

32． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和下端三分之一處（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）棕色或乳黃色樣品帶

33． 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

34． 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

35． 進(jìn)一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

36． 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

37． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F）

38． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為100000g

39． 小心抽去上清液

40． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻

41． 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

二、 化學(xué)處理法

實驗開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent D）凍融，然后移出移取10微升活性液（Reagent D）、1毫升凈化液（Reagent C）到4毫升的裂解液（Reagent B）里，混勻后，置入冰槽里，標(biāo)記為裂解工作液。然后進(jìn)行下列操作。

1． 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長鋪滿整個培養(yǎng)表面

2． 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面，然后抽去

3． 重復(fù)實驗步驟2一次

4． 加入3毫升用戶自備的YIDANBAIMEI乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個細(xì)胞生長表面

5． 置入37℃培養(yǎng)箱3分種

6． 輕輕手擊震動培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落

7． 分別加入10毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液

8． 移入一個50毫升錐形離心管

9． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g

10． 小心抽去上清液

11． 加入10毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A）

12． 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g

13． 小心抽去上清液

14． 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液

15． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

16． 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次

17． 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）

18． 渦旋震蕩5秒，充分混勻

19． 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項8）

20． 加入5毫升預(yù)冷的裂解液（Reagent B），輕輕搖動試管混勻

21． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1000g

22． 小心移出上清液到另一個新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解細(xì)胞

23． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心20分鐘，速度為12000g

24． 小心移出上清液到預(yù)冷的6毫升超速離心管——此步驟獲得線粒體組分（post mitochondrialfraction；PMF）

25． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心60分鐘，速度為100000g

26． 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒――此步驟獲得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分

27． 即刻加入500微升保存液（Reagent F），充分混勻沉淀物

28． 置于冰槽里備用

29． 準(zhǔn)備1個6毫升超速離心管

30． 加入2.5毫升高純液（Reagent G）

31． 小心沿著管壁，在高純液（Reagent G）上面，一滴一滴加入2.5毫升分層液（Reagent H）（注意：避免晃動）

32． 小心沿著管壁，在分層液（Reagent H）上面，一滴一滴加入500微升上述內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組分（注意：避免晃動）

33． 小心放進(jìn)4℃超速離心機(jī)再次離心30分鐘，速度為130000g

34． 小心取出超速離心管：可見上端三分之一處（滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）和下端三分之一處（粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）棕色或乳黃色樣品帶

35． 小心抽去滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

36． 小心收集滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

37． 進(jìn)一步抽去粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶以上的液體

38． 小心收集粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品帶到另一個2毫升離心管（注意：用3毫升針筒和18號針頭，置于樣品帶下緣小心緩慢抽吸）——此步驟獲得高純粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)樣品

39． 分別加入1至2毫升保存液（Reagent F）

40． 放進(jìn)4℃超速離心機(jī)離心10分鐘，速度為100000g

41． 小心抽去上清液

42． 分別加入500微升保存液（Reagent F），混勻

43． 放進(jìn)－70℃冰箱里保存

注意事項

1． 本產(chǎn)品為10次（5 X 10⁷動物細(xì)胞）操作

2． 操作時，須戴手套

3． 操作時，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent F）

4． 所有操作均須在4℃或以下狀態(tài)進(jìn)行

5． 建議使用足夠的樣品量

6． 建議嚴(yán)格控制操作時間

7． 通常勻化次數(shù)為20至40下（或細(xì)胞顆粒群消失為止）達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)

8． 通常孵育5分鐘（不宜超過5分鐘）達(dá)到80％的組織細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的細(xì)胞類型會存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時間和渦旋震蕩次數(shù)

9． 對于難以裂解的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理

10． 腦組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉淀顆粒非常松動，注意操作損失

11． 通常5 X 10⁷動物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)含量為500至1000微克蛋白

12． 本產(chǎn)品所獲得的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)純度達(dá)95%以上

13． 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志蛋白是NADPHXIBAOSESUC還原酶（NADPH Cytochrome C Reductase）；建議使用 組織NADPHXIBAOSESUC還原酶活性比色法定量檢測試劑盒－50303.2

14． 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的標(biāo)志是核糖體RNA（ribosome RNA）；建議使用 RNA熒光（RiboGreen）定量檢測試劑盒——20129

15． 本公司提供系列亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持正?；钚?/span>

3． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定不含污染性蛋白酶和核酶