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革蘭氏陰性細菌外膜囊泡制備試劑盒產(chǎn)品說明書

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革蘭氏陰性細菌外膜囊泡制備試劑盒產(chǎn)品說明書 

 

主要用途

革蘭氏陰性細菌外膜囊泡制備試劑是一種旨在使用速離心,分離并收集所有細胞外膜囊泡的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。適合于各種革蘭氏陰性細菌外膜囊泡及其蛋白的純化。產(chǎn)品即到即用,性能穩(wěn)定,操作便捷,萃取產(chǎn)量和純度皆佳。

 

技術(shù)背景

外膜囊泡(outer membrane vesicle;OMV)為含有周質(zhì)內(nèi)容物(包括外膜蛋白、DNA、RNA、脂多糖、脂質(zhì)、周質(zhì)蛋白、黏附素、免疫調(diào)節(jié)化合物等)的球形電子致密芽狀體(spherical bud),細胞外間隔體,雙層磷脂,20至200納米大小,來自于革蘭氏陰性細菌周邊突起物的釋放形成或胞外分泌產(chǎn)物,使之與環(huán)境或宿主細胞進行反應(yīng),并調(diào)解各種功能,包括促進病理形成,調(diào)節(jié)細菌互動,轉(zhuǎn)運各種信號分子(例如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、毒力因子等),保護細菌生存、結(jié)合和侵入,引起毒性,產(chǎn)生抗生素抗性等。外膜囊泡的產(chǎn)量取決于細菌生長周期、營養(yǎng)條件、溫度、氧化應(yīng)激狀態(tài)等。病原菌的外膜囊泡10倍于非病原菌體。外膜囊泡具有疫苗開發(fā)中免疫調(diào)節(jié)潛力。通過差速離心和蛋白酶抑制混合劑,獲得高純外膜囊泡,充分保留蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性。

 

產(chǎn)品內(nèi)容

保存液Reagent A)        毫升

溶解液(Reagent B)        毫升

活性液(Reagent C)        微升

產(chǎn)品說明書   1份

 

保存方式

保存活性液(Reagent C)在-20℃冰箱里其余的保存在4℃冰箱里,有效保證6

 

用戶自備

50毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管:用于樣品保存的容器

分光光度儀:用于測定細菌濃度

臺式離心機:用于樣品操作

超速離心機:用于樣品操作

恒溫搖床:用于培養(yǎng)細菌細胞

0.45微米濾膜:用于樣品操作

真空濃縮裝置:用于樣品操作

 

實驗步驟 

實驗開始前,將試劑盒里的活性液(Reagent C從-20的冰箱里取出,置入冰槽里凍融,然后移出xx毫升解液(Reagent B到1.5毫升離心管,加入xx微升活性液(Reagent C,充分混勻,置于冰槽里,標(biāo)記為解工作液。然后進行下列操作。

  • 準(zhǔn)備好1毫升過夜培養(yǎng)的新鮮細菌樣品
  • 移取500微升到50毫升細菌培養(yǎng)液(注意:用戶可以進行誘導(dǎo)培養(yǎng),例如無鐵培養(yǎng)等)
  • 放進37恒溫搖床孵育過夜,速度為200RPM
  • 在分光光度儀上測OD60011 OD1 X 109細胞/毫升;總量為5 X 1010細胞) 
  • 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的50毫升錐形離心管
  • 放進4℃臺式離心機離心30分鐘,速度為5000g
  • 小心移取上清液到新的50毫升錐形離心管
  • 重復(fù)實驗步驟6和7一次
  • 使用0.45微米濾膜真空過濾一次
  • (選擇步驟)使用100kD蛋白臨界點濃縮處理
  • 放進4超速離心機離心3小時,速度為150000g
  • 小心抽去上清液
  • 加入xx微預(yù)冷的保存液(Reagent A)
  • 或加入xx微升預(yù)冷的含有 解液(Reagent B活性液(Reagent C解工作液
  • 用槍頭上下抽吸,充分混勻
  • 轉(zhuǎn)移到到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 即刻放進-70冰箱里保存或置于冰槽里備用
  • 進行后續(xù)蛋白定量、熒光定量或電鏡檢測等

 

注意事項

  • 本產(chǎn)品為20次(50毫升菌液)操作
  • 所有操作須4℃狀態(tài)下進行
  • 建議使用新鮮細菌接種,培養(yǎng)到指數(shù)生長階段為理想狀態(tài)
  • 活性液Reagent C)避免反復(fù)凍融
  • 本產(chǎn)品按照50毫升培養(yǎng)菌液配制。如果操作不同菌液容量,可相應(yīng)調(diào)整試劑用量
  • 根據(jù)菌種不同,50毫升(OD6001)菌液可獲得5至100微克外膜囊泡蛋白
  • 制備產(chǎn)物如果放在-70冰箱里儲存?zhèn)溆?/span>,嚴(yán)格避免反復(fù)凍融
  • 本公司提供系列細菌試劑產(chǎn)品
      

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
  • 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無蛋白酶污染

 

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