細(xì)胞PTEN活性定磷比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

細(xì)胞PTEN活性定磷比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在使用特異性合成底物磷脂酰肌醇-3 ,4 ,5-三磷酸（PIP3），在PTEN去磷酸化后，釋放出游離磷酸根，與孔雀綠染料發(fā)生顯色反應(yīng)后，采用比色法測(cè)定其峰值的變化，以此進(jìn)行測(cè)算單位酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適合于各種細(xì)胞裂解懸液樣品的PTEN活性及其抑制劑的檢測(cè)。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞凋亡、蛋白組學(xué)、病理生理學(xué)、神經(jīng)病變等研究。產(chǎn)品不含污染性蛋白酶，嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，反應(yīng)優(yōu)化，檢測(cè)敏感。

技術(shù)背景

細(xì)胞張力蛋白同源在10號(hào)染色體缺失性磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten；PTEN；EC3.1.3.67），又稱為多發(fā)性晚期腫瘤突變基因1（mutated in multiple advanced cancers 1；MMAC1），是一個(gè)腫瘤抑制基因，位于染色體10q23.3，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物515kb，蛋白產(chǎn)物175氨基酸。PTEN蛋白含有一酪蛋白磷酸酶的功能區(qū)和約175個(gè)氨基酸左右的與骨架蛋白張力蛋白（tenasin）、輔助蛋白（auxilin）同源的區(qū)域，是一種雙重特異性磷酸酶，能使酪氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、磷酯酰肌醇（phosphoinositide）等去磷酸化。PTEN具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、防止細(xì)胞過度生長(zhǎng)和分開裂解、參與細(xì)胞凋亡、粘附、遷移、浸潤(rùn)，控制細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇-3 ,4 ,5-三磷酸（Phosphatidylinositol-3,4,5- trisphosphate；PIP3）水平，調(diào)控Akt/PKB信號(hào)通路等功能。PTEN基因突變和缺失將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移，以及多發(fā)性錯(cuò)構(gòu)瘤綜合征（Cowden syndrome）等。基于底物磷脂酰肌醇-3 ,4 ,5-三磷酸，在PTEN的催化下，水解產(chǎn)生磷脂酰肌醇-4 ,5-二磷酸（PIP2），同時(shí)釋放出游離磷酸根，進(jìn)而與孔雀綠染料發(fā)生顯色反應(yīng)產(chǎn)生其峰值的變化（660nm波長(zhǎng)），以此測(cè)算PTEN的活性。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A） 120毫升

裂解液（Reagent B）    10毫升

緩沖液（Reagent C）   1毫升

陰性液（Reagent D）     1毫升

反應(yīng)液（Reagent E） 200微升

終止液（Reagent F）     1毫升

顯色液（Reagent G）   4毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H） 500微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）、緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent E）和顯色液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；其余的保存在4℃冰箱里；終止液（Reagent F）和顯色液（Reagent G）具有腐蝕性，避免直接用手接觸；顯色液（Reagent G）避免光照，有效保證6月

用戶自備

15毫升離心管：用于樣品處理的容器

1.5毫升離心管：用于樣品處理和保存的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于貼壁細(xì)胞脫離

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品收集

培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液放進(jìn)冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

• 樣品準(zhǔn)備
  • 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（5 X 10⁶細(xì)胞）
  • 小心加入3毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
  • 小心抽去清理液
  • 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞 
  • 加入3毫升清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
  • 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
  • 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
  • 小心抽去上清液
  • 加入500微升裂解液（Reagent B），充分混勻
  • 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
  • 置于冰槽里孵育30分鐘
  • 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
  • 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
  • 移取2微升進(jìn)行蛋白定量測(cè)定（注意：建議使用 Bradford 蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30030.1）
  • 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：樣品須澄清）
• 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長(zhǎng)為660nm，并置零  
• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 按下表分別加入陰性液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到每個(gè)離心管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

• 移取20微升陰性液（Reagent D）到新的比色皿
• 加入5微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 加入8微升終止液（Reagent F），混勻
• 加入100微升顯色液（Reagent G），混勻
• 室溫下靜置15分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至7四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光單位（A）；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)磷濃度（微摩爾/升）

• 樣品背景測(cè)定

• 移取20微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入5微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） 
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 加入8微升終止液（Reagent F），混勻
• 加入100微升顯色液（Reagent G），混勻
• 室溫下靜置15分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度

• 樣品活性測(cè)定

• 移取10微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入5微升待測(cè)樣品（總量100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白） 
• 在37℃溫度下孵育2分鐘
• 加入10微升反應(yīng)液（Reagent E）
• 在37℃溫度下孵育10分鐘
• 加入8微升終止液（Reagent F），混勻
• 加入100微升顯色液（Reagent G），混勻
• 室溫下靜置15分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度

• 計(jì)算樣品活性

{[根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）—根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品背景對(duì)應(yīng)磷濃度（微摩爾/升）]X 5（體系倍數(shù)）X樣品稀釋倍數(shù)}÷ 10（反應(yīng)時(shí)間；分鐘）＝納摩爾磷/毫升/分鐘÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝納摩爾磷/毫克/分鐘

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括5次標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定
• 操作時(shí)，避免污染母液
• 操作時(shí)，須戴手套
• 終止液（Reagent F）和顯色液（Reagent G）具有腐蝕性，避免直接用手接觸
• 樣品切忌使用磷酸緩沖液和脫氧膽酸納處理
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*
• 如果用戶沒有660nm波長(zhǎng)，可以使用600至660nm的任一波長(zhǎng)替代
• 顯示綠色表明具有較強(qiáng)酶活性
• 空白對(duì)照讀數(shù)應(yīng)小于0.2
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為100微克/5微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量； （本公司提供 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－HL30030.1）
• 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 8.0的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）釋放1微摩爾的磷
• 本公司提供系列磷酸化酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)準(zhǔn)確