1.雜交瘤的克隆化

　　雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經(jīng)過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數(shù)個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化?？寺』脑瓌t是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

　　克隆化的方法很多，zui常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

2. 雜交瘤的凍存與復蘇

    雜交瘤細胞的凍存：及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩(wěn)定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養(yǎng)過程中隨時可能發(fā)生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

　　雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養(yǎng)環(huán)境不同而改變，在24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。50%小牛血清、40%不*培養(yǎng)液及10%DMSO（二甲基亞砜）是常用的細胞凍存液。凍存液預冷，操作時動作要輕且迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃后放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩(wěn)定性，在液氮中細胞可保存數(shù)年或更長時間。

    細胞復蘇方法：將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用*培養(yǎng)液洗滌兩次，然后移入頭天已制備好的飼養(yǎng)層細胞的培養(yǎng)瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。