一、服務(wù)介紹
免疫熒光細胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。
二、實驗原理
將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。
三、實驗流程
免疫熒光單標記方法
免疫熒光單標記是指只標記一種蛋白質(zhì)分子，方法比較簡單，只要按照染色步驟去做，通常不存在太多的問題。但要注意固定液的選擇，固定液選擇的合適與否，可能會直接影響染色結(jié)果。具體染色方法如下。
1、所需材料與試劑
a、培養(yǎng)在蓋玻片或玻璃培養(yǎng)皿中融合程度達到60%-70%的細胞。
b、一抗、FITC或TRITC標記的二抗。
c、4%多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液 (-20℃預(yù)冷20 min)。
d、封閉液。
e、 0.01mol／LPBS緩沖液。
2、染色方法
a、取出培養(yǎng)有細胞的蓋玻片或glass-bottom培養(yǎng)皿，用0.01MPBS洗2-3遍。
b、加入0.3%的Tritonx-100, 37℃, 30 rain
c、加入4%多聚甲醛試問固定30 min或冷丙酮4℃固定10 min。
d、正常阻斷血清1:20封閉試問20-30 min，抑制IgG的非特異性結(jié)合。阻斷血清必須選擇與二抗同一種屬的正常血清。
e、去掉正常血清，直接加入一抗，37℃孵育1 h或4℃過夜?？贵w以0.01 mo/LPBS稀釋(理想的抗體濃度需經(jīng)試驗而定)。
f、0.3% TritonX-100洗5 min，0.01 mol/IPBS洗5 min，0.3% TritonX 5 min，0.01 M PBS洗5 rain。
g、加入FITC-二抗或TRITC-二抗，37℃，孵育1h。
h、0.3%TritonX-100洗5rain，0.01 mol/LPBS洗5min，0.3% Triton X 5min，0.01mol/LPBS洗5 min，用濾紙吸干。
i、90%甘油(PBS配制)封片。
j、激光掃描共焦顯微鏡下觀察，或于4℃避光保存。
免疫熒光雙標記方法
免疫熒光的雙標記是指同時標記細胞內(nèi)兩種蛋白質(zhì)分子，當懷疑某種配體與已知受體結(jié)合后可用此方法加以證明。此方法稍微復(fù)雜一些，首先應(yīng)注意所用的一抗必須是來自不同種屬動物的兩種特異性抗體(例如：A抗體為多克隆抗體，來自家兔；B抗體為單克隆抗體，來自小鼠)。其次，兩種二抗所帶熒光素的發(fā)射光不應(yīng)重疊，且盡量遠離，通常可以選擇FITC和TRITC、Alex488和TRITC、FITC和Cy5，或Cy3和Cy5等來組合。通常情況下，染色時兩種一抗可以同時孵育，然后可以同時孵育兩種二抗。但當染色結(jié)果一種顏色非常弱，而另一種顏色比較強時，應(yīng)考慮先孵育顏色較弱的二抗。其他步驟同免疫熒光單標記。
四、客戶提供
細胞株或細胞爬片。注：細胞爬片不宜太密；細胞必須固定。組織切片，一抗
五、公司提供
基本實驗步驟、藥品、樣品處理、圖片及圖片分析，熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡拍攝
實驗周期：1-3周
