*還原酶（glutathione reductase, GR）說明書
分光光度法 50 管/48 樣
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
GR 是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是*氧化還原循環(huán)的關(guān)鍵酶之一（通常昆蟲中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 還原 GSSG 生成 GSH，有助于維持體內(nèi) GSH/GSSG 比值。GR 在氧化脅迫反應(yīng)中對(duì)活性氧清除起關(guān)鍵作用，此外 GR 還參與抗壞血酸－*循環(huán)途徑。
測(cè)定原理：
GR 能催化 NADPH 還原 GSSG 再生 GSH，同時(shí) NADPH 脫氫生成 NADP+；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，相反 NADP+在該波長無吸收峰；通過測(cè)定 340 nm 吸光度下降速率來測(cè)
定 NADPH 脫氫速率，從而計(jì)算 GR 活性。
自備儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水
試劑組成和配置：
試劑一：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5.0 mL 蒸餾水，混勻。
試劑三：液體 3mL×1 支，4℃保存。
粗酶液提取：
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測(cè)。
2. 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測(cè)。
3. 血清等液體：直接測(cè)定。
操作步驟：
1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑一置于 25℃（普通物質(zhì)）或者 37℃（哺乳動(dòng)物）中預(yù)熱 30min。
3. 測(cè)定管：取 1mL 石英比色皿，依次加入 50μL 試劑三，100μL 試劑二， 750μL 試劑一，
100μL 上清液，迅速混勻，于 340nm 測(cè)定 10 s 和 190 s 吸光度，記為 A 測(cè) 1 和 A 測(cè) 2，△A
測(cè)定管= A 測(cè) 1﹣A 測(cè) 2。(注意加完上清液后迅速混勻測(cè)定)
計(jì)算公式：
(1). 按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ △A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109]÷[Cpr×V 樣]÷T
= 536×△A 測(cè)定管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為
1 個(gè)酶活單位。
GR 酶活(nmol/min/g 鮮重)= [ △A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T = 536×△A 測(cè)定管÷W
(3) 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每 104 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GR 酶活(nmol/min/104 cell)= [ △A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109] ÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T
= 536×△A 測(cè)定管÷細(xì)胞數(shù)量
（4）按液體體積計(jì)算
活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個(gè)酶活單位。
GR 酶活(nmol/min/mL)= [ △A 測(cè)定管÷ε÷d×V 反總×109]÷×V 樣÷T
= 536×△A 測(cè)定管
ε：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×103L/mol/cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1000μL=0.001 L；
106：1 mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL =0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，
3 min。
注意事項(xiàng)：
（1）樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行，且須在當(dāng)日測(cè)定酶活力，勻漿液避免反復(fù)凍融；（2）試劑二須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天內(nèi)使用完。（3）測(cè)定前須先用 1～2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，哺乳動(dòng)物組織一般須用試劑一稀釋 2～5 倍。
（4）細(xì)胞中 GR 活性測(cè)定時(shí)，細(xì)胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細(xì)胞中 GR 的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞。
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