抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性測(cè)定試劑
盒說(shuō)明書(shū)
分光光度法 50 管/48 樣
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗壞血酸代謝的關(guān)鍵酶之一。APX 具有多種同功酶，分別定位于葉綠體、胞質(zhì)、線粒體、過(guò)氧化物和乙醛酸體，以及過(guò)氧化體和類(lèi)囊體膜上。APX 催化 H2O2 氧化 AsA，是植物 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影響到 AsA 的含量，APX 與 AsA 具有一定的負(fù)相關(guān)性。
測(cè)定原理：
APX 催化催化 H2O2 氧化 AsA，通過(guò)測(cè)定 AsA 氧化速率，來(lái)計(jì)算得 APX 活性。
自備儀器用品：
低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)、1mL 石英比色皿、移液槍、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體 90mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5 mL 蒸餾水充分溶解。
試劑三：液體 5mL×1 支，4℃保存。
粗酶液提取：
按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g 組織，加入 1mL 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測(cè)。
測(cè)定：
- 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 290nm，用蒸餾水調(diào)零。
- 試劑一在 25℃中預(yù)熱 30min。
- 依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、700μL 預(yù)熱的試劑一、100μL 試劑二和
100μL 試劑三，迅速混勻后在 290nm 測(cè)定 10 s 和 130 s 光吸收 A1 和 A2，△A=A1-A2。
APX 活性計(jì)算公式：
- 按樣本蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：每毫克蛋白每分鐘氧化 1μmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。
APX(μmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反總×106÷(Cpr×V 樣)÷T
=1.79×△A÷ Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：每 g 組織每分鐘氧化 1μmol AsA 為 1 個(gè)酶活單位。 APX(μmol/min/g 鮮重 ) = △A÷(ε×d）×V 反總×106÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
=1.79×△A ÷W
ε：AsA 在 290nm 處摩爾吸光系數(shù)為 2.8×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑（cm），1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），1000μL=1×10-3 L；106：1mol=1×106μmol；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），100μL=0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測(cè)定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min），2min。
注意事項(xiàng)：
配制好的試劑二 4℃保存，并且 3 天內(nèi)使用完。
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