產(chǎn)品名稱:人解整合素樣金屬蛋白酶9(ADAM9)elisa試劑盒
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產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T
檢測方法: ELISA酶聯(lián)免疫法
說 明 書:隨貨發(fā)送,也可直接在線銷售索取
測試種屬:人、大小鼠、豚鼠、兔子、牛、羊、豬、雞、鴨elisa試劑盒等種屬
檢測目的:用于測定血清,血漿及相關(guān)液體等樣本。例如適合檢測包括血清、血漿、尿液、胸腹水、灌洗液、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等標本。
試劑盒保存及有效期:2-8℃,避光保存:6個月。
產(chǎn)品產(chǎn)地:進口/國產(chǎn)
產(chǎn)品庫存:現(xiàn)貨
品牌:自主研發(fā)/進口原裝
產(chǎn)品價格:*,洽談!
試劑盒使用范圍:僅供科研檢測,不得用于臨床.
產(chǎn)品價格:*,洽談!
簡介酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbent assay簡稱ELISA)是在免疫酶技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)。ELISA過程包括抗原(抗體)吸附在固相載體上稱為包被,加待測抗原(抗體),再加相應(yīng)酶標記抗體(抗原),生成抗原(抗體)-待測抗體(抗原)-酶標記抗體的復(fù)合物,再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計的光吸收計算抗體(抗原)的量。待測抗體(抗原)的定量與有色產(chǎn)生成正比。
二、ELISA試劑盒組成
1. 微孔板 (固相抗體) 96 well
2. 標記抗體 (30倍濃縮,HRP標記抗體) 0.4 ml
3. 標準品 0.5 ml × 2
4. EIA緩沖液 (1% BSA, 0.05% Tween-20 含有PBS) 30 ml
5. 標記抗體稀釋液 (1% BSA, 0.05% Tween-20 含有PBS) 12 ml
6. 顯色液 (TMB底物液) 15 ml
7. 終止液 (1N硫酸) 12 ml
8. 洗滌緩沖濃縮液 (40倍濃縮,0.05% Tween-20的磷酸緩沖液) 50 ml
三、ELISA法的應(yīng)用
1.免疫酶染色各種細胞內(nèi)成分的定位。
2.研究抗酶抗體的合成。
3.顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4.定量檢測體液中抗原或抗體成分。
四、ELISA實驗要點
洗滌:洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外,手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種,過程如下:
(1)浸泡式 a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液;b.用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后,即甩去);c.浸泡,即將洗滌液注滿板孔,放置1-2分鐘,間歇搖動,浸泡時間不可隨意縮短;d.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)*,可用水泵或真空泵抽吸,也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;e.重復(fù)操作c和d,洗滌3-4次(或按說明規(guī)定)。在間接法中如本底較高,可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,非離子型洗滌劑既含疏水基團,也含親水基團,其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合,從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用,使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,其濃度可在0.05%-0.2%之間,高于0.2%時,可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
(2)流水沖洗式 流水沖洗法zui初用于小珠載體的洗滌,洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置,使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗,持續(xù)沖洗2分鐘后,吸干液體,再用蒸餾水浸泡2分鐘,吸干即可。浸泡式猶如盆浴,流水沖洗式則好比淋浴,其洗滌效果更為*,且也簡便、快速。已有實驗表明,流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓,讓水流沖擊板孔表面,洗滌效果更佳。
五、標本的收集和保存
1.要注意避免出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團,其有類似過氧化物的活性,因此,在以HRP為標記酶的ELISA測定中,如血清標本中血紅蛋白濃度較高,則其就很容易在溫育過程中吸附于固相,從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。
2.樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染,一則細菌的生長,其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;二則一些細菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標記的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
血清標本如是以無菌操作分離,則可以在2~8℃下保存一周,如為有菌操作,則建議冰凍保存。樣本的長時間保存,應(yīng)在-70℃以下。
3.冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,從而引起假陰性結(jié)果。此外,凍融標本的混勻亦應(yīng)注意,不要進行劇烈振蕩,反復(fù)顛倒混勻即可。
4.標本在保存中如出現(xiàn)細菌污染所致的混濁或絮狀物時,應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。
六、公司現(xiàn)貨報價標本要求
1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2.不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
七、ELISA操作中的洗滌
a)洗液不要溢出孔外,以免污染相鄰的孔,特別是每次洗板的前兩遍,若高濃度的孔污染了低濃度的孔或空白孔,其造成的交叉污染的孔是洗不掉的,背景肯定會增高。
b)特別注意:設(shè)計實驗的時候要考慮實驗孔的位置,保證甩掉洗液時,空白孔、低濃度孔或陰性對照組在上面或一側(cè)或分開。同時注意甩掉洗液的動作翻轉(zhuǎn)(從正上方旋轉(zhuǎn)120-150度)要迅速、干脆。甩板不要手腕左右搖擺、旋轉(zhuǎn)來甩液體!甩出后以直線方式補2-3次甩出液體。
c)用干凈的濾紙,不要用衛(wèi)生紙,因為細小粉塵或者碎屑容易吸附到孔底,導(dǎo)致洗板不干凈,結(jié)果偏高或偏低,重復(fù)孔的數(shù)值也會相差很大。
d)每次拍板不要重復(fù)在一個地方拍,特別是洗去酶的步驟;拍板不宜過輕,否則拍不干凈,拍板很用力不會對蛋白有什么影響。但注意不要太重,以至把板條給拍斷。每次洗板后輕叩幾下,zui后一次一定要扣干凈。
e)不能減少洗液體積、洗板時間和次數(shù)。洗板時間太短,洗板效果不佳。延長洗板時間和增加洗板次數(shù)可以使背景更干凈。
八、樣本處理及要求
1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。
2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。
3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。
4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。
5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?/span>2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。
6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
九、魚熱應(yīng)激蛋白70 (HSP70) ELISA試劑盒公司現(xiàn)貨報價操作技術(shù)流程
1、準備:從冰箱取出試劑盒,室溫復(fù)溫平衡30分鐘。
2、配液:用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3、加標準品和待測樣本:取足夠數(shù)量的酶標包被板,固定于框架上,分別設(shè)置標準品孔、待測樣本孔和空白對照孔,記錄各孔位置,在標準品孔中加入標準品50μL;待測樣本孔中先加入待測樣本10μL,再加*40μL(即樣本稀釋5倍);空白對照孔不加。
4、溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5、洗板:棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)。
6、加酶標工作液:每孔加入酶標工作液50μL,空白對照孔不加。
7、溫育:重復(fù)4的操作。
8、洗板:重復(fù)5的操作。
9、顯色:每孔先加入顯色劑A 液50μL,再加入顯色劑B液 50μL,37℃避光顯色15min。
10、終止:取出酶標板,每孔加終止液50μL,終止反應(yīng)(顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
11、測定:以空白孔調(diào)零,在終止后15分鐘內(nèi),用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。
12、計算:根據(jù)標準品的濃度及對應(yīng)的OD值,計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣本的OD值,在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣品濃度,也可以使用各種應(yīng)用軟件來計算。zui終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)。
八、公司現(xiàn)貨報價計算
以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即為樣品的實際濃度。
九、ELISA試劑盒檢測范圍和保存條件及有效期
1ng/L -30ng/L
1.試劑盒保存:;2-8℃。
2.有效期:6個月
十、ELISA試劑盒性能
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990以上。
2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和11%
十一、ELISA試劑盒常見問題
問:比如說我偶然發(fā)現(xiàn)只加*的也出現(xiàn)淺黃色,這怎么解釋呢?
答:可能的原因:
1、洗板時有交叉感染
2、*中本身有本底的一個較小的讀數(shù)。也是ELISA的一個局限性,免疫的很多反應(yīng)稀釋液 洗滌液發(fā)揮了很重要的作用,不加的話效果不明顯,但是加了以后有些成分可能有一部分的干擾作用。 可以比較不同的廠家的盒子 都存在這些局限性的,但不影響zui終的結(jié)果。ELISA嚴格的說就是一個半定量的方法。
問:特殊稀釋液是做什么的?
答:一般情況都不要用的,他的zui大的用途就是稀釋標準品。但是,現(xiàn)在標準品已經(jīng)稀釋好了 所以不需要用了。如果你需要更多的標準品,可以用他來稀釋。
問:ELISA試驗的標準曲線和測定的重復(fù)性差,這是什么原因造成的?
答:ELISA試驗的標準曲線和測定的重復(fù)性差,這是典型的由測定操作引起的問題,常見原因如下:
a)可能原因:ELISA加樣本及試劑量不準;孔間不*;
解決方法:校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密。
重復(fù)某一樣品時,加樣時間盡可能與*次接近;
重復(fù)測定標本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持*,以排除這些因素造成的不*的可能性;
樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。
b)可能原因:加樣過快,孔間發(fā)生污染;
解決方法:重復(fù)測定標本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持*,以排除這些因素造成的不*的可能性;加樣不要過快。