污水處理養(yǎng)殖糞便設備

畜禽糞便中重金屬如Cu、Zn、As等間接促進了抗生素抗性基因的產生.如表 4所示，某些重金屬和抗生素具有相同的抗性機制，因此，在重金屬抗性增加的同時，可能會導致抗生素抗性的產生或加強(Ji et al., 2012).如Berg等(2010)通過未培養(yǎng)的方法，證明了Cu對四環(huán)素和*的抗性基因具有聯合選擇壓力.Silveira等(2014)研究了從各種環(huán)境中篩選出的腸球菌(Enterococcus)中Cu抗性基因和ARGs的聯合轉移情況

結果發(fā)現，微生物的Cu抗性對腸球菌中的多重耐藥性產生了選擇壓力，證明了Cu抗性基因(tcrB和cueO)在腸球菌中的水平轉移，并且這種Cu抗性的水平轉移同時伴隨著*、四環(huán)素、*、*、*、氨芐*等多種抗性的轉移.Nishino等(2007)研究了多重耐藥菌沙門氏菌中雙組分調控系統BaeSR，結果發(fā)現，當調節(jié)因子baeR高效表達時，能夠顯著提高Salmonella enterica的多重耐藥性和Cu、Zn的抗性，baeR控制了mdtABC操縱子和tolC、acrD的表達，mtdABC和acrD同時決定了Salmonella enterica的多重耐藥性和Cu、Zn的抗性.

也就是說，Cu和Zn的選擇壓力均會導致baeR的高效表達，進而影響mdtABC操縱子和tolC、acrD的表達，從而導致Salmonella enterica抗生素抗性的增加.因此，在考察畜禽糞便土地利用對土壤中抗生素抗性基因的影響時，不僅應該考慮抗生素類物質，而且應考慮Cu、Zn、As等微量元素的影響.

表4 具有相同抗性機制的重金屬和抗生素

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土壤中土著細菌含有許多抗性基因，現在用于大規(guī)模生產的抗生素生產菌基本都來自于土壤.但是，同畜禽糞便相比，土壤細菌自身攜帶的抗性基因無論在數量上還是在自身屬性上均有很大區(qū)別.例如，在數量上，Yang等(2010)采用實時定量PCR方法，雖然沒有在美國洛杉磯國家公園土壤中檢測到tetB、tetC、tetW和tetO，但這些基因卻大量存在于其它受農業(yè)活動影響的276個土壤樣品中.

其次，從抗性基因屬性來看，土著細菌所攜帶的抗性基因大多同微生物正常的新陳代謝在一起，使微生物在低濃度的抗生素條件下生存，很少同水平轉移因子結合在一起(Baquero et al., 2009).但是，在較大的環(huán)境選擇壓力下，如畜禽糞便中所含的抗生素和重金屬，這些抗性基因會進行復制，并轉移到轉座子和質粒上以獲得更高的抗性水平.而這些轉座子和廣譜的質?；蛘咂渌幕驍U散因子，進入更大范圍的微生物，從而使抗性基因得到了傳播(Martínez2007 et al., 2007).

　　目前有關施用畜禽糞便的土壤中重金屬抗性基因的分布特征尚未見報道，但是施用含重金屬的有機糞肥后，土壤中微生物的重金屬和抗生素抗性均產生了明顯的變化.如Berg等(2010)的研究表明，含Cu有機肥進行土地利用后，Cu的加入不僅增加了土著微生物的Cu抗性，而且間接增加了具有Cu抗性微生物的抗生素抗性.

　　總之，現階段畜禽糞便土地利用過程中抗生素、重金屬、抗生素抗性基因的分布特征研究多集中在單因素，不僅缺乏復合污染條件下抗生素抗性基因的遷移與傳播機制研究，而且重金屬抗性基因的遷移轉化有待進一步明確，同時迫切需要深入研究畜禽糞便的施用頻率、施用量、施用時間和土壤類型、植物類型等對土地利用過程中抗生素和重金屬及其抗性基因賦存與轉歸的影響.

　　5 抗生素和重金屬抗性基因產生、轉移、分布的微生物學機理

　　抗生素抗性基因在不同環(huán)境中相互影響，并呈現一定的性.已有調查顯示，從未使用過抗生素的環(huán)境中，抗生素抗性基因的數量卻在逐年增加(Segawa et al., 2013)，這同抗性基因的傳播方式和途徑息息相關.

　　現階段發(fā)現的微生物對抗生素產生抗性的機制主要有4種(Allen et al., 2010)：細胞通透性障礙、外排泵、抗性突變和抗生素失活機制.不同抗生素產生的抗性機制不一樣.以四環(huán)素抗性基因為例(圖 1)，迄今為止主要有35種類型的四環(huán)素抗性基因，包括外排泵機制24種、抗生素失活機制1種、核糖體保護蛋白機制(抗性突變機制)10種(McArthur et al., 2013).一般在研究抗生素抗性基因分布的時候，往往選擇特定幾種抗性基因來研究，以四環(huán)素抗性基因為例，外排泵機制選擇tetG、tetA、tetC等較多，酶失活機制選擇tetX

核糖體保護蛋白機制選擇tetM和tetQ較多.這幾類四環(huán)素抗性基因在環(huán)境中豐度一般比較高，具有代表性.不同環(huán)境中并不是存在所有抗性機制的抗性基因，這可能同定量PCR方法有一定的檢測限有關.如Zhu等(2013)采用定量PCR方法檢測到了28種四環(huán)素抗性基因中的22種.隨著分子生物學技術的不斷發(fā)展，新的抗性基因也不斷被發(fā)現.如Su等(2014)利用功能基因組學的方法，篩選了不同土壤環(huán)境樣品中多種抗生素抗性基因，結果發(fā)現，同已發(fā)現的抗生素抗性基因相比，氨基酸水平上只有2%的抗性基因的相似性在90%以上，67%以上抗性基因的相似性低于60%.這說明環(huán)境中還有很多尚未被認識的抗性基因.另外，微生物不斷進化，人們相信新的抗生素抗性機制也會隨之產生(Karisetty et al., 2013).

圖 1 四環(huán)素抗性基因

水體、土壤和工業(yè)廢棄物中的許多微生物都表現出了對重金屬的抗性.同抗生素抗性基因一樣，重金屬抗性基因存在于染色體、質粒和轉座子，有時兩者連接在一起.由于不同重金屬的電化學性質不一樣，微生物對其抗性機制也有較大差別.現階段主要有6種重金屬抗性機制：細胞通透性障礙、細胞內外螯合、外排泵、酶解毒和降低受體敏感性.目前針對環(huán)境樣品中重金屬抗性的研究比較多，但是針對重金屬抗性基因的研究比較少，大多是針對某個具體的微生物.

以Cu為例，研究較多的是黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)中的抗性基因變化情況.如Behlau等(2013)研究了同柑橘相關的黃單胞桿菌屬中Cu抗性基因的變化情況，證明了Cu抗性基因復雜的來源.Abou-Shanab等(2007)的研究結果表明，各種重金屬的抗性基因都是大量存在于從含重金屬Ni豐富的土壤及庭薺根際中篩選出的G+菌和G-菌.