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上海邦景實業(yè)有限公司
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?ELISA試劑盒實驗過程問題處理知道
2024-3-25 閱讀(76)
ELISA試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優(yōu)點, 深受廣大用戶朋友的喜愛.然而,在實驗過程中,也需要注意很多問題.對此, 需要遵守一些規(guī)則,才能更好地進行實驗,取得較好的實驗成果。Elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定，在Elisa測定中影響因素較多,在檢測過程中除正常反應(yīng)外,有時常見到一些錯誤的結(jié)果。Elisa實驗中應(yīng)該注意的問題,包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問題。
1．樣品稀釋
一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗確定,以保證試驗的靈敏度和特異性。酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),如果血清不稀釋,不可避免會產(chǎn)生很強的非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陽性。
2．試劑盒平衡
Elisa中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20～30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠,樣品孵育時間相對縮短,ELISA反應(yīng)不夠充分.冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3．樣品和試劑的混勻
在稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗的均一性。
4．加樣
加樣是一項很重要的步驟.加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡.加樣太快,無法保證微量加樣的準確性和均一性.加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附。
5．溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個因素.ELISA作為一種固相免疫測定,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全結(jié)合,必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。
6．洗板
固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù),需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來,以保證ELISA測定的特異性.洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干；及時更換吸水紙,尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗結(jié)果。
7．顯色
顯色一定要控制時間,根據(jù)試劑盒說明操作即可.一般來說,顯色時間過短,結(jié)果偏低；顯色時間過長,空白增高或者非特異性顯色增加。
8．比色
比色要注意波長的選擇.以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長為450nm,后者為492nm,濾光片需根據(jù)要求隨時更換.因此,容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。
