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PCR反應循環(huán)參數(shù)優(yōu)化
2024-5-6 閱讀(57)
實時熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
PCR反應條件的控制：
1. PCR反應的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 。
2. 鎂離子濃度 總量應比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L。
3. 底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制，20～200 umol/L。
4. TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）。
5. 引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L。
6. 反應溫度
（1）變性溫度和時間95℃，30 s。
（2）退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
（3）延伸溫度和時間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）。
（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)
7. 循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達到有效的 擴增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期"。
PCR的循環(huán)參數(shù)：
1. 預變性（Initial denaturation）
模板DNA全變性與PCR酶的全激活對PCR能否成功至關(guān)重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。
2. 循環(huán)中的變性步驟
循環(huán)中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列全變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹di，易造成擴增失敗。
3. 引物退火（Primer annealing）
退火溫度需要從多方面去決定，一般根據(jù)引物的Tm值為參考，根據(jù)擴增的長度適當下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。
退火溫度對PCR的特異性有較大影響。
4. 引物延伸
引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略
延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。
5. 循環(huán)數(shù)
大多數(shù)PCR含25-40循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。
6. 最后延伸
在最后一個循環(huán)后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。
