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細(xì)胞傳代培養(yǎng)消化法具體操作步驟
2024-6-18 閱讀(65)
當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，將會出現(xiàn)密度抑制現(xiàn)象，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。此時如果不及時進(jìn)行分裝再培養(yǎng)，即傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸走向衰老、死亡。將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個容器以1∶2或其他比率轉(zhuǎn)移到其他容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)。
細(xì)胞傳代培養(yǎng)消化法具體操作步驟：
一、傳代前準(zhǔn)備：
1.預(yù)熱培養(yǎng)用液：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和yi蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。
2.用75%酒精擦拭經(jīng)過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
5.準(zhǔn)備好將要使用的消毒后的空培養(yǎng)瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。
6.取出預(yù)熱好的培養(yǎng)用液：取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內(nèi)。
7.從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞：注意取出細(xì)胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細(xì)胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。
二、yi 蛋白酶消化
1.加入消化液：小心吸出舊培養(yǎng)液，用PBS清洗(沖洗)，加入適量消化液(yi蛋白酶液)，注意消化液的量以蓋住細(xì)胞最好，最佳消化溫度是37℃。
2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞，若胞質(zhì)回縮，細(xì)胞之間不再連接成片，表明此時細(xì)胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養(yǎng)液：棄去yi 蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養(yǎng)液。
三、吹打分散細(xì)胞
1.吹打制懸：用滴管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。
2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6～8分鐘。
4.棄上清液，加入新培養(yǎng)液：棄去上清液，加入2ml培養(yǎng)液，用滴管輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。
四、分裝稀釋細(xì)胞：
1.分裝：將細(xì)胞懸液吸出分裝至2-3個培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞量，必要是計數(shù)。注意密度過小會影響傳代細(xì)胞的生長，傳代細(xì)胞的密度應(yīng)該不低于5×105/ml。最后要做好標(biāo)記。
五、繼續(xù)培養(yǎng)：
用酒精棉球擦拭培養(yǎng)瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。傳代細(xì)胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當(dāng)生長細(xì)胞鋪展面積占培養(yǎng)瓶底面積25%時為一個+，占50%為++，占75%時為+++。
