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PCR反應(yīng)體系引物應(yīng)遵循哪些原則？
2025-2-5 閱讀(59)
PCR反應(yīng)具有突出的優(yōu)勢，如特異性，靈敏度，高產(chǎn)率，快速，簡便，可重復(fù)性好，易于自動化。它可以在試管中分析待研究的靶基因，或者可以在幾個小時內(nèi)將某個基因片段擴增到十萬甚至一百萬次，使肉眼可以直接觀察判斷。從頭發(fā)，一滴血甚至是細胞中提取的DNA都可以擴增出足夠數(shù)量的DNA用于分析研究和測試鑒定。PCR技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項舉措和里程碑。因此，PCR反應(yīng)體系構(gòu)建是非常必要的。
PCR反應(yīng)體系構(gòu)建設(shè)計中引物應(yīng)遵循什么原則：
1、引物長度：15-30bp，通常在20bp左右；
2、引物擴增范圍：200-500bp為宜，具體條件可擴增大10kb的片段；
3、引物堿基：40%-60%的G+C含量合適，G+C太少，擴增效果差，G+C太容易出現(xiàn)非特異性條帶。ATGC是隨機分布的，避免了5種以上的電子核苷酸嘯叫或字符串排列；
4、避免引物的二級結(jié)構(gòu)，避免兩個引物之間的互補，尤其是3'末端互補，否則會形成引物二聚體以產(chǎn)生非特異性擴增條帶；
5、引物3'末端的堿基，尤其是后一個和倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴格配對，以避免末端堿基的堿基錯配導(dǎo)致PCR失敗。
6、引物具有或可以加入合適的限制位點。擴增的靶序列應(yīng)具有合適的限制位點。這適合進行限制性分析或分子克隆非常有益；
7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫中的其他序列沒有明顯的同源性。
