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α-木糖苷酶試劑盒,微板法

α-木糖苷酶試劑盒,微板法

本試劑盒僅供科研使用 1 α-木糖苷酶（α- xylosidase）活性測(cè)定試劑盒說明書 （貨號(hào)：WS3170W 微板法 48 樣） 一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介 ： α-木糖苷酶(EC 3.2.1.177)是一類木聚糖降解水解酶，存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物 體，促使非還原末端α-D-木糖殘基的水解，釋放出α-D-木糖。 α-木糖苷酶催化對(duì)硝基*酚-α-D-木糖苷產(chǎn)生對(duì)硝基*酚（PNP），該產(chǎn)物在 405nm 處 有特征吸收峰，通過測(cè)定 405nm 光吸收增加速率，即可計(jì)算α-木糖苷酶活性。 二、試劑盒的組成和配制： 試劑名稱 規(guī)格 保存要求 備注 提取液 液體 60mL×1 瓶 4℃保存 試劑一 粉劑 mg×1 支 4℃保存 用前甩幾下使試劑落入底部， 再加 1.4mL 蒸餾水溶解備用。 試劑二 液體 5 mL×1 瓶 4℃保存 試劑三 液 20 mL×1 瓶 4℃保存 標(biāo)準(zhǔn)品 粉劑×1 支 4℃保存 若重新做標(biāo)曲，則用到該試劑 三、所需的儀器和用品： 酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液器、低溫離心機(jī)、天平、研缽、冰和蒸餾水。 四、α-木糖苷酶活性測(cè)定： 建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！ 1、樣本的制備： ① 組織樣本：取約 0.1g 組織（水分充足的樣本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，進(jìn)行冰 浴勻漿。12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量(g)：提取液體積(mL)為 1：5~10 比例提取。 ② 細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì) 胞，加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；12000rpm，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】若增加樣本量，可按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè))：提取液體積(mL)為 500~1000：1 的比例提取。 ③ 液體樣本：直接檢測(cè)。若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。 2、上機(jī)檢測(cè)： ① 酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 405nm。 ② 在 EP 管中依次加入： 試劑名稱（μL） 測(cè)定管 對(duì)照管 樣本 10 10 試劑一 25 蒸餾水 25 試劑二 45 45 迅速混勻，40℃保溫 20min 試劑三 180 180 混勻， 取 200μL 轉(zhuǎn)移到 96 孔板中，405nm 處測(cè)定吸光 值 A，ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照（每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管）。 【注】：若ΔA 低于 0.01，可增加樣本取樣量 V1（如增至 30μL，則試劑三相應(yīng)減少），本試劑盒僅供科研使用 2 或延長(zhǎng)保溫時(shí)間（如：40min 或更長(zhǎng)），或增加樣本質(zhì)量 W，則改變后的 V1 和 T 和 W 需代入計(jì)算公式重新計(jì)算。 五、結(jié)果計(jì)算： 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 0.0401x+0.0028；x 為標(biāo)準(zhǔn)品摩爾質(zhì)量（nmol），y 為ΔA。 2、按蛋白濃度計(jì)算： 定義：40℃下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基*酚（PNP）為一個(gè)酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1×Cpr)÷T =124.7×(ΔA-0.0028)÷ Cpr 3、按樣本質(zhì)量計(jì)算： 定義：40℃下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基*酚（PNP）為一個(gè)酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×W)÷T =124.7×(ΔA-0.0028)÷W 4、 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算： 定義：40℃下，每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基*酚（PNP）為一酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.0028)÷0.0401÷(V1÷V×細(xì)胞數(shù)量)÷T =124.7×(ΔA-0.0028)÷細(xì)胞數(shù)量 5、按液體體積計(jì)算： 定義：40℃下，每毫升液體每分鐘催化產(chǎn)生 1 nmol 對(duì)硝基*酚（PNP）為一個(gè)酶活單位。 α-木糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(ΔA-0.0028) ÷0.0401÷V1÷T=124.7×(ΔA-0.0028) V---加入提取液體積，1mL； V1---加入反應(yīng)體系中樣本體積，10μL=0.01mL； W---樣本質(zhì)量，g； 500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬； T---反應(yīng)時(shí)間，20min； PNP 對(duì)分子質(zhì)量---139.11。 Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒； 附：標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程： 1 制備標(biāo)準(zhǔn)品母液（1mg/mL）：向標(biāo)準(zhǔn)品 EP 管里面加入 1ml 蒸餾水。 2 把母液稀釋成以下濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mg/mL。也可根據(jù)實(shí)際 樣本來調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)品濃度。 3 在 EP 管加入：10μL 標(biāo)準(zhǔn)品+25μL 蒸餾水+45μL 試劑二+180μL 試劑三，混勻，取 200μL 至 96 孔板中，于 405nm 下讀取吸光值。 4 根據(jù)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。