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上海雅吉生物科技有限公司
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PCR實(shí)驗(yàn)中DNA聚合酶的選擇及實(shí)驗(yàn)方法
2019-5-29 閱讀(4140)
一、 DNA聚合酶的選擇
實(shí)驗(yàn)室常用 DNA聚合酶有三種：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTMDNA Polymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA 聚合酶，保真性較差，但價錢便宜，一般用于基因表達(dá)的檢測等。TaKaRaEXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐熱性 DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物 3’端附有一個 “A ”堿基，如果希望直接將產(chǎn)物克隆 到 T -vector可以用此酶。
PyrobestTMDNA Polymerase 也是具有Proof reading 活性的耐熱性DNA 聚合酶，其特點(diǎn)是保真性*，擴(kuò)增得到的 PCR產(chǎn)物為平滑末端。如果進(jìn)行基因的擴(kuò)增 請使用此酶。
二、按下列組成在PCR 反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液
TaKaRaTaqTM或TaKaRaE XTaqTM的配方
| Reagent | Quantity,for 50µ l of reactionmixture |
|---|---|
| 10X PCR buffer （Mg2+free） | 5 µl |
| MgCl2（25mM） | 如 TaKaRaTaqTM加 3 µl |
| 如 TaKaRaEXTaqTM加 4 µl | |
| 2.5mMdNTP mix | 4 µl |
| 10µ M Primer 上游 | 1 µl |
| 10µ M Primer 下游 | 1 µl |
| TemplateDNA | 1 µl |
| Taq或E XTaqDNAPolymerase | 0.25 µl |
| Steriledeionizedwater | Up to 50µl |
| Total | 50 µ l /Sample |
PyrobestTMDNA Polymerase的配方
| Reagent | Quantity,for 50µ l of reactionmixture |
|---|---|
| 10X Pyrobestbuffer | 5µl |
| 2.5mMdNTP mix | 4µl |
| 10µ M Primer 上游 | 1µl |
| 10µ M Primer 下游 | 1µl |
| TemplateDNA | 1µl |
| PyrobestTMDNA Polymerase | 0.25µl |
| Steriledeionizedwater | Up to 50µ l |
| Total | 50µ l /Sample |
①反應(yīng)總體積根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)控，可以做 20~50µ l以節(jié)約試劑；
②將上表各成分加入到 0.2ml或 0.5ml滅菌的 PCR薄壁管中；
如果不用 PCR儀的加熱蓋，在反應(yīng)混合液的上層加 30 ~ 50µ l的礦物油 防止樣品在 PCR的過程中蒸發(fā)；
三、按以下程序進(jìn)行PCR 擴(kuò)增
PCR 反應(yīng)條件視模板、引物等的結(jié)構(gòu)條件不同而各異，在實(shí)際操作中需根據(jù)具體的情況以及 PCR結(jié)果而進(jìn)行優(yōu)化。
| Step | Temperature,° C | Time,min | Number of cycles | Note |
|---|---|---|---|---|
| 起始變性 | 94~95 | 1~3 | 1 | |
| 變性 | 94~95 | 0.5~2 | 25~35 | 退火溫度比理論退火溫度大概低 5°C，再根據(jù)反應(yīng)結(jié)果優(yōu)化 |
| 退火 | 37-70 | 0.5~2 | ||
| 延伸 | 70-75 | 根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小 | 每分鐘延伸 1000bp | |
| 終延伸 | 70-75 | 10 | 1 |
反應(yīng)結(jié)束后，抽取擴(kuò)增樣品 5µ l，用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，用DNA marker判斷擴(kuò)增片段的大小或冷凍保存，以備以后分析使用
