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上海雅吉生物科技有限公司
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軟瓊脂細胞克隆形成實驗
2019-12-9 閱讀(2926)
軟瓊脂細胞克隆形成實驗說明：
1）材料的準備和配置：
1) 準備2×基礎培養(yǎng)基：去離子水溶解1 g粉末培養(yǎng)基和0.2 g碳酸氫鈉，終體積為50 ml，0.2 μm濾器過濾除菌。
1) 在100 ml去離子水中加入1 g的瓊脂，配制1%的瓊脂。在100 ml去離子水中加入0.6 g的瓊脂制備0.6%的瓊脂。高壓滅菌瓊脂溶液，可儲存在4°C，實驗時應再次加熱到瓊脂*溶解為止。
.2. 鋪下層瓊脂
1) 松開1%軟瓊脂的瓶蓋，微波加熱1-2 min，密切關注以防沸騰。繼續(xù)加熱，不時攪拌以混合，直到瓊脂*溶解至澄清。
2) 把融化的瓊脂溶液和預熱的2×培養(yǎng)基放在42°C水浴鍋。6孔板每孔需要1.5 ml的瓊脂與培養(yǎng)基的混合物。為了保證足量的混合物，每個6孔板準備12 ml混合物。首先加6 ml培養(yǎng)基到50 ml離心管中，再加6 ml的1%瓊脂溶液。顛倒離心管幾次以混勻，動作輕快以防軟瓊脂過早凝固。
3) 5 ml血清移液管每孔加1.5 ml混合物，避免氣泡沉在底部。
4) 蓋上板蓋，室溫凝固30 min。
3. 鋪含有細胞的上層瓊脂
1) 下層瓊脂凝固后，開始準備上層瓊脂。首先，胰酶消化收集細胞。細胞計數(shù)，制備細胞懸液。按1000, 3000, 5000個細胞/ml制備細胞懸液(使用2×*培養(yǎng)基配置，每孔需0.75 ml細胞懸液和0.75 ml瓊脂，共1.5 ml)。每孔按1.5 ml體積算，需要準備12 ml的細胞懸液。
2) 微波加熱0.6%瓊脂，把融化的瓊脂溶液和3.3步驟制備的細胞懸液放在42°C水浴鍋。
3) 按1：1比例混合0.6% 瓊脂和細胞懸液，每個6孔板需要12 ml混合液。每孔1.5 ml。轉(zhuǎn)移6 ml細胞懸液到50 ml離心管中。然后加6 ml 0.6%的瓊脂。注意：混合液溫度要保持42℃，避免凝固。
4) 動作迅速，用移液管吹打2-3次混勻混合液，然后用5 ml的血清移液管吸取5.5 ml的混合物。每孔加1.5 ml混合物，避免氣泡沉在底部。
5) 細胞/瓊脂混合物室溫凝固30分鐘，然后放入37℃細胞培養(yǎng)箱中。足夠的菌落形成所需時間因每個細胞系而異，通常為21 d左右（本實驗周期為14 d）。
6) 瓊脂上層應保持一層生長培養(yǎng)基，以防止干燥。每星期加兩次100 μl的培養(yǎng)基。
4. 平板染色和菌落計數(shù)
1) 每孔加200 μl結晶紫染色15-20 min。
2) 菌落染色后，用成像儀拍攝照片并用圖像分析軟件計算菌落數(shù)。
