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上海雅吉生物科技有限公司
主營產(chǎn)品： 培養(yǎng)原代細(xì)胞,細(xì)胞系價(jià)格,耐藥細(xì)胞株,實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒 |
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免疫組化操作步驟
2021-3-9 閱讀(4067)
免疫組化操作步驟
一、免疫組化操作步驟
(一)、儀器設(shè)備
1、 18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或用微波爐
2、 水浴鍋
(二)、試 劑
1、 PBS緩沖液(pH7.2―7.4)
2、 0.01mol/L檸檬酸鈉緩沖液(CB,pH6.0,1000ml)
3、 3%甲醇―H2O2溶液：用30% H2O2 和80%甲醇溶液配制
4、 風(fēng)裱劑：
a. 甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.0–9.5)等量混合
b. 油和TBS(PBS)配制
5、 TBS/PBS pH9.0–9.5，適用于熒光纖維鏡標(biāo)本；pH7.0-7.4適合光學(xué)纖維標(biāo)本
(三)、操作流程
1、 脫蠟和水化：脫蠟前應(yīng)將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘
a. 組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后在浸泡10分鐘
b. 無水乙醇中浸泡五分鐘
c. 95%乙醇中浸泡五分鐘
d. 75%乙醇中浸泡五分鐘
2、 抗原修復(fù)：用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片
二、抗原修復(fù)(免疫組化石蠟切片)
用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片需要抗原修復(fù)。
福爾馬林固定的組織有可能破壞了原來組織的抗原結(jié)構(gòu)，蛋白多肽發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致部分抗原表位封閉，結(jié)合位點(diǎn)減少，所以需要抗原修復(fù)，以暴露原來的抗原表位，達(dá)到充分顯露抗原，以不出現(xiàn)明顯脫片現(xiàn)象為佳。
抗原修復(fù)的幾種常用方法(供參考)
1、 微波爐加熱：
在微波爐里加熱0.01枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5-10分鐘，反復(fù)1-2次。根據(jù)玻片情況可參考采用微波加熱“3-5-3法”3分鐘溫火沸騰后靜止5分鐘，再溫火沸騰3分鐘即可。
適用的抗原：來源于人、大鼠、小鼠的組織標(biāo)本；來源于其他動物種屬的組織標(biāo)本。
2、 沸熱修復(fù)：
電爐或水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖液(pH6.0)至95℃左右，放入組織芯片加熱10-15分鐘。
3、 高壓熱修復(fù)：
在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0).蓋上不銹鋼鍋蓋，但不能鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡五分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后除去熱源，置入涼水中，當(dāng)小閥門沉下去后打開蓋子。此方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復(fù)。(骨及軟骨組織的標(biāo)本好選擇較溫和的微波加熱修復(fù)) 。
4、 酶消化方法：
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預(yù)熱37℃，消化時(shí)間約為5-30分鐘。
適用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等。
三、石蠟切片免疫組化染色步驟
1、三步法(以SP試劑盒為例)
- 石蠟切片脫蠟至水
- 蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鐘，如果采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行
- 3% H2O2 室溫孵育5~10分鐘，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗，2分鐘×3次
- 5~10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時(shí)或4℃過夜
- PBS沖洗，2分鐘×3次
- 滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)，37℃孵育10~30分鐘；或滴加第二代生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘
- PBS沖洗，2分鐘×3次
- 滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃孵育10~30分鐘；或第二代辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~20分鐘
- PBS沖洗，2分鐘×3次
- 顯色劑顯色(DAB或AEC)
- 自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明、封片
- 如果必要，可選用avdin封閉內(nèi)源性生物素
2.SABC法
- 脫蠟、水化
- PBS洗2次各5分鐘
- 用蒸餾水或PBS配制新鮮的3% H2O2 ，室溫封閉5-10分鐘，用蒸餾水洗3次
- 抗原修復(fù)
- PBS洗5分鐘
- 滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘，甩去多余液體
- 滴加Ι抗50ul,室溫靜置1小時(shí)或4℃過夜或37℃1小時(shí)
- PBS洗3次各2分鐘
- 滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分鐘
- PBS洗3次各2分鐘
- 滴加試劑SABC 20℃-30℃ 20分鐘
- PBS洗4次各5分鐘
- DAB顯色：試劑盒或自配顯色劑顯色
- 脫水、透明、封片、鏡檢
四、冰凍切片的免疫組化染色步驟
- 速凍組織
- 冰凍切片4~8μm，冰凍切片后如不染色，必須吹干，儲存低溫冰箱內(nèi)，或進(jìn)行短暫預(yù)固定后儲存于-20℃冰箱
- 室溫放置30分鐘后，入4℃丙酮固定10分鐘，也可根據(jù)需要選擇其他的固定方式
- PBS沖洗，5分鐘×3次
- 用3%過氧化氫孵育5~10分鐘，消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性
- PBS沖洗，5分鐘×3次
- 下接石蠟切片免疫組化染色操作步驟(滴加一抗開始)
第二節(jié) 免疫組化抗原熱修復(fù)的技術(shù)要點(diǎn)(供參考)
一、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系
我們?nèi)粘９ぷ髦兴褂玫慕M織固定液福爾馬林會引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如下：
一步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的化合物；
第二步：基本反應(yīng)福爾馬林和氫反應(yīng)形成新的亞甲基橋。
上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式： 抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度(T) × 加熱時(shí)間(t)。
也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就越長；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇*暴露，這種反比的關(guān)系從MBI單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果“表1”中也可以清楚地看出。
表1 時(shí)間和溫度對染色的影響
如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對免疫組化進(jìn)行定量的需要。這就給我們診斷中定量指標(biāo)的應(yīng)用帶來困難，例如用來測定耐藥的指標(biāo)。
二、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系
大量的實(shí)驗(yàn)表明，固定時(shí)間越長的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長，組織中蛋白對溫度的耐受也相應(yīng)增高，這可能就是我們對固定時(shí)間長的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。
這就提醒我們在做回顧性的研究時(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。
三、不同pH值抗原修復(fù)液對染色結(jié)果的影響
抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH值也會對染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。
pH值對染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況：
A.穩(wěn)定型，pH值對染色結(jié)果影響不大，如PCNA、AE1、EMA、CD20等；
B.V型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-5染色結(jié)果較差，如ER、Ki-67等；
C.上升型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如HMB45等；
D.下降型，隨著pH值的增加染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如MOC31。
一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高pH值都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高pH值得修復(fù)液，如1mMEDTA, pH8.0或pH9.0等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用pH6.0的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高pH值得修復(fù)液來代替目前廣為使用的pH6.0枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出pH8.0和pH9.0的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用pH9.0得修復(fù)液效果都要優(yōu)于pH6.0的枸櫞酸，尤其是核陽性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高pH值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢。
四、抗原熱修復(fù)的手段
表2 微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)的比較
目前抗原熱修復(fù)所采用的方法主要有微波爐修復(fù)和高壓鍋修復(fù)兩種，從“表2”中可以看出，由于高壓鍋修復(fù)具有溫度均一、節(jié)省時(shí)間、效果穩(wěn)定等特點(diǎn)，已經(jīng)越來越受到人們的青睞。
