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上海雅吉生物科技有限公司
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質(zhì)粒提取步驟
2021-9-1 閱讀(3797)
一、實(shí)驗(yàn)原理：
堿裂解法提取質(zhì)粒是根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 與線(xiàn)性染色體DNA 在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在pH 值介于12.0 ～12.5 這個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，線(xiàn)性的DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而被變性，盡管在這樣的條件下，共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA 的氫鍵會(huì)被斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈彼此相互盤(pán)繞，仍會(huì)緊密地結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH 4.8 的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復(fù)pH 至中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA 的兩條互補(bǔ)鏈仍保持在一起，因此復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線(xiàn)性的染色體DNA 的兩條互補(bǔ)鏈彼此已*分開(kāi)，復(fù)性就不會(huì)那么迅速而準(zhǔn)確，它們纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA ，蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。
二、操作步驟：
1. 準(zhǔn)備20ml滅菌過(guò)的培養(yǎng)管，編號(hào)，分別加入8ml LB培養(yǎng)基，再加入8µl 相應(yīng)抗生素，可適量多加；
2. 用10µl 白色槍頭挑取挑取單個(gè)菌落至培養(yǎng)管中，37℃震蕩過(guò)夜（274rpm）；
3. 取2ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加入離心管中，室溫10000rpm離心2min，去上清；（可重復(fù)步驟2，直至菌液離心完）（去上清時(shí)用紙吸一下）
4. 向留有菌體沉淀的離心管中加入250µl Buffer P1（含RNase A），使用移液槍充分混勻，懸浮菌體菌體；
5. 向離心管中加入250µl Buffer P2，溫和地上下顛倒混勻4~6次，獲得澄清的裂解液；（劇烈混合會(huì)使剪切染色體DNA，降低質(zhì)粒純度）
6. 向離心管中加入350µl Buffer N3， 立即溫和地上下顛倒混勻4~6次，此時(shí)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。室溫10000rpm離心15min；
7. 小心將步驟6中所得的上清液轉(zhuǎn)移至潔凈的吸收柱中。要保證沒(méi)有吸入沉淀和細(xì)胞碎片。室溫10000rpm離心1min，至裂解物*通過(guò)吸收柱,倒掉收集管中的廢液；
8. 向吸附柱中加150µl Buffer PB，10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液；
9. 向吸附柱中加400µl Buffer PW（檢查是否加入無(wú)水乙醇），10000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液。再空離一次，2min（此時(shí)可以加熱 Buffer EB，65~70℃）；
10. 將吸附柱置于一個(gè)新的離心管中，打開(kāi)蓋子，吹風(fēng)4min左右（確保乙醇被去除，乙醇會(huì)影響下面的步驟）；
11. 向吸附柱的吸附膜中間部位加90µl Buffer EB（pET系列拷貝數(shù)低，加EB 70μl即可），室溫靜置2min。10000rpm離心1min；
12. 把液體倒回吸附柱，在10000rpm離心1min；
13. 混合質(zhì)粒至一個(gè)離心管中，做好標(biāo)記，開(kāi)蓋室溫放置兩小時(shí)左右。-40℃保存質(zhì)粒。
三、注意事項(xiàng)：
1.使用之前，把試劑盒中的一小管RNA酶加入Buffer P1， 4℃保存。
2.Buffer EB在65~70℃水浴預(yù)熱，可以增加提取效率。
