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上海雅吉生物科技有限公司
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更新時間：2019-06-05 13:32:44瀏覽次數(shù)：237
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KOPN-8人前B淋巴瘤細胞的以下實驗方案介紹了貼壁培養(yǎng)哺乳動物細胞傳代的一般流程。請注意昆蟲細胞與哺乳動物細胞傳代的一些關(guān)鍵步驟有所不同。
1）裝有貼壁細胞的培養(yǎng)容器
2）經(jīng)過組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿
3）*生長培養(yǎng)基，預(yù)熱至 37°C
4）一次性無菌 15-mL 試管
5）37°C 培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為 5% 的濕化空氣
6）平衡鹽溶液，例如：杜爾貝科鹽緩沖液 (DPBS)，不含、鎂和紅
7）解離劑，例如：胰蛋白酶或 TrypLE™ Express，不含紅
8）用于活細胞和總細胞計數(shù)的試劑和設(shè)備，例如：Countess® 自動細胞計數(shù)儀、臺盼藍染料和血球計數(shù)器，或者 Coulter Counter® (Beckman Coulter)
KOPN-8人前B淋巴瘤細胞傳代的*步是通過酶或機械方法將細胞從培養(yǎng)容器表面解離下來。
貼壁細胞傳代流程
所有與細胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術(shù)，并且在層流通風(fēng)櫥內(nèi)工作。
1 .從培養(yǎng)容器中吸出用過的細胞培養(yǎng)基并丟棄。
2 .用不含和鎂的平衡鹽溶液沖洗細胞 (每 10 cm 2 培養(yǎng)表面積需要2 mL溶液)。從與貼壁細胞層相對的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數(shù)次。
注：沖洗步驟可去除可能抑制解離劑作用的少量血清、和鎂。
3 .從培養(yǎng)容器中吸出沖洗液并丟棄。
4 .向培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱的解離劑 (例如：胰蛋白酶或 TrypLE™)；試劑量應(yīng)足以覆蓋細胞層(每 10 cm 2 大約 0 .5 mL)。輕輕搖晃容器，使試劑*覆蓋細胞層。
5 .將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約 2 分鐘。請注意實際孵育時間根據(jù)所用細胞系不同而有所差異。
6 .在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達 90%，可將孵育時間延長幾分鐘，每30 秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細胞解離。
7 .細胞解離程度大于等于 90% 時，傾斜培養(yǎng)容器，使細胞上液體盡快流盡。加入所用解離劑兩倍體積的預(yù)熱*生長培養(yǎng)基。吹打細胞層表面數(shù)次，使培養(yǎng)基分散。
8 .將細胞轉(zhuǎn)移到 15-mL 錐形管中，以 200 × g 的離心力離心 5 至 10 分鐘。請注意離心速度和時間依細胞種類不同而有所差異。
9 . 用少體積的預(yù)熱*生長培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀，取出少量樣品進行計數(shù)。
10 .采用血球計數(shù)器、細胞計數(shù)儀按照臺盼藍拒染法或者使用 Countess® 自動細胞計數(shù)儀測定總細胞數(shù)和活細胞百分比。必要時，可再次向細胞中加入生長培養(yǎng)基，以便達到所需的細胞濃度，并重新進行細胞計數(shù)。
注：我們建議使用 Countess® 自動細胞計數(shù)儀測定總細胞數(shù)和活細胞百分比。Countess®自動細胞計數(shù)儀計數(shù)所需的樣本量與您目前使用的血球計數(shù)器所需量相同，且不到一分鐘即可完成一個樣本的典型細胞計數(shù)，適用于各種真核細胞。有關(guān)傳統(tǒng)血球計數(shù)器使用的更多信息，請參閱第 41 頁的"支持技術(shù)方案"部分。
11 .將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細胞懸液轉(zhuǎn)移到新的細胞培養(yǎng)容器中，把細胞放回培養(yǎng)箱。
注：如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應(yīng)將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋。
細胞的傳代
懸浮細胞傳代比貼壁細胞傳代稍微簡單一些。由于細胞已經(jīng)在生長培養(yǎng)基中懸浮，因此無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，整個過程較為迅速，對細胞的損傷也較小。懸浮培養(yǎng)時不進行生長培養(yǎng)基的更換；而是每 2 到 3 天加料一次，直到細胞匯合?？梢灾苯釉谂囵B(yǎng)瓶中稀釋細胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)擴增，或者也可以從培養(yǎng)瓶中取出一部分細胞，將余下的細胞稀釋到該細胞系適宜的接種密度。懸浮細胞傳代后的延滯期一般比貼壁細胞短。
小鼠神經(jīng)元細胞(原代細胞)懸浮培養(yǎng)容器
懸浮培養(yǎng)可采用未經(jīng)組織培養(yǎng)處理的無菌培養(yǎng)瓶 (例如：不帶折流板的搖瓶) 進行；但是，專為懸浮細胞培養(yǎng)設(shè)計的轉(zhuǎn)瓶 (即：攪拌瓶)具有出色的氣體交換功能，可進行較大規(guī)模的細胞培養(yǎng)。
轉(zhuǎn)瓶有兩種基本設(shè)計；其培養(yǎng)基由懸掛的攪拌棒或者垂直的葉輪攪拌 (即攪動)。垂直葉輪的換氣效果更佳。轉(zhuǎn)瓶總培養(yǎng)體積不能超過轉(zhuǎn)瓶標示體積的一半，以便換氣充分(例如：500 mL 轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)液體不能超過 250 mL)。
