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上海雅吉生物科技有限公司
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簡并引物設(shè)計(jì)
細(xì)刺奧斯特線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒簡并引物常用于從已知蛋白到相關(guān)核酸分子的研究及用于一組引物擴(kuò)增一類分子。
簡并引物設(shè)計(jì)方法
（1）利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質(zhì)或cDNA編碼的氨基酸序列 因?yàn)槊艽a子的關(guān)系，不同的核苷酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTP（通過蛋白查蛋白），在整個(gè)NR數(shù)據(jù)庫中查找與之相似的氨基酸序列。
（2）對(duì)所有的序列進(jìn)行多序列比對(duì) 將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)， 可選工具有Clustal W/X， 也可在線分析。所有序列的共有部分將會(huì)顯示出來。 “*”表示保守， “：”表示次保守。
（3）確定合適的保守區(qū)域 設(shè)計(jì)簡并引物至少需要上下游各有一個(gè)保守區(qū)域， 且兩個(gè)保守區(qū)域相距50~400個(gè)氨基酸殘基為宜， 使得PCR產(chǎn)物在150~1200bp之間，重要的是每一個(gè)保守區(qū)域至少有6個(gè)氨基酸的保守區(qū)，因?yàn)槊織l引物至少18bp左右。
若比對(duì)結(jié)果保守性不是很強(qiáng)很可能找不到6個(gè)氨基酸序列的保守區(qū)，這時(shí)可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣關(guān)系近的物種進(jìn)行二次比對(duì)，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進(jìn)行三次比對(duì)，總之，究竟要選多少序列來比對(duì)，要根據(jù)前一次的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。終目的就是有兩個(gè)6個(gè)氨基酸且兩者間距離合適的保守區(qū)域。
（4）利用軟件設(shè)計(jì)引物 當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計(jì)引物了， 其中Primer 5.0 支持簡并引物的設(shè)計(jì)， 將參與多序列比對(duì)的序列中的任一條導(dǎo)入Primer 5.0 中，將其翻譯成核苷酸序列，該序列群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C， K=G/T， S=C/G， W=A/C/T， B=C/G/T，V=A/C/G， D=A/G/T， N=A/C/G/T， 該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對(duì)應(yīng)部分，在Primer 5.0 中修改參數(shù)，令其在兩個(gè)距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對(duì)，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會(huì)有數(shù)對(duì)，分?jǐn)?shù)越高越好。
（5）對(duì)引物的修飾 若得到的引物為：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
則簡并度=4×2×4×3×4×3×2=2304， 很明顯該條引物的簡并度很高不利于PCR， 可以通過次黃嘌呤代替N（因?yàn)榇吸S嘌呤可以很好的和4種堿基配對(duì)）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度。
這樣設(shè)計(jì)出來的簡并引物對(duì)，適用于比對(duì)的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。
細(xì)刺奧斯特線蟲染料法熒光定量PCR試劑盒簡并引物設(shè)計(jì)原則
從蛋白到核酸， 請(qǐng)注意：
（1） 盡量選擇簡并度低的氨基酸區(qū)域?yàn)橐镌O(shè)計(jì)區(qū)，如蛋氨酸和色氨酸僅有一個(gè)密碼子。
（2） 充分注意物種對(duì)密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。
（3） 引物不要終止于簡并堿基，對(duì)大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物的3末端 不要位于密碼子的第三位。
（4） 在簡并度低的位置，可用次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。
以上幾點(diǎn)遵循的總的原則為： 盡量降低引物的簡并度，尤其在3'末端或近3'末端。
