研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于Cas12a的多重核酸檢測系統(tǒng)CASTI，CASTI系統(tǒng)通過互補(bǔ)序列阻斷報告DNA（探針）來調(diào)節(jié)Cas12a的反式裂解活性，該系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)單反應(yīng)、單Cas效應(yīng)蛋白、兩個靶標(biāo)基因的同時檢測。作者結(jié)合重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，準(zhǔn)確且高靈敏度地同時檢測低至1 aM的HPV 16和18靶標(biāo)，驗(yàn)證了CASTI平臺的可行性。

發(fā)表在Biosensors and Bioelectronics期刊上的論文“Cas12a/blocker DNA-based multiplex nucleic acid detection system for diagnosis of high-risk human papillomavirus infection”，開發(fā)了一種基于Cas12a的多重核酸檢測系統(tǒng)CASTI，該系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)單反應(yīng)、單Cas效應(yīng)蛋白、兩個靶標(biāo)基因的同時檢測。該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在只有Cas12a單一效應(yīng)蛋白的單一反應(yīng)管中對高危HPV的快速多重檢測，是一種用戶友好且經(jīng)濟(jì)的基于Cas系統(tǒng)的多重核酸檢測替代方案。

基于CRISPR/Cas12a對ssDNA底物的反式切割活性高于dsDNA底物的特性，作者提出了基于單一CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的多重核酸檢測策略：無靶標(biāo)存在時，報告DNA（探針）與阻斷劑DNA互補(bǔ)，形成“報告探針-阻斷劑”dsDNA結(jié)構(gòu)（R/B），抑制Cas12a/crRNA/activator三元復(fù)合物行使反式裂解活性，產(chǎn)生可忽略的熒光信號；靶標(biāo)存在時，靶標(biāo)與阻斷劑DNA結(jié)合，報告DNA（探針）以ssDNA的形式釋放，并被激活的Cas12a/crRNA/activator三元復(fù)合物反式剪切，產(chǎn)生高熒光信號（圖1a）。

R-CASTI的檢測原理為：RPA反應(yīng)（靶標(biāo)特異性識別與放大），T7 RNA聚合酶以RPA產(chǎn)物為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，生成HPV 16和HPV 18 的RNA產(chǎn)物，靶標(biāo)RNA產(chǎn)物分別與HPV 16和HPV 18的阻斷劑正交結(jié)合，并釋放相應(yīng)單鏈報告探針（圖3）。Cas12a反式裂解報告探針，產(chǎn)生強(qiáng)烈的FAM和Cy5信號。

作者評估了R-CASTI系統(tǒng)在最佳條件下對HPV 16或18的檢測靈敏度和檢測特異性。通過對不同HPV類型的L1基因進(jìn)行多序列比對，作者選定了分別被HPV 16和18引物特異性識別的位點(diǎn)1和2（圖4a）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。作者使用R-CASTI系統(tǒng)和選定的RPA引物集，檢測了不同濃度的HPV 16或18存在時的熒光信號。R-CASTI系統(tǒng)高靈敏檢測HPV 16和HPV 18（圖4 b-c)，檢測限（LOD）為1 aM（約0.6 拷貝/μL）。R-CASTI系統(tǒng)能有效地區(qū)分低靶標(biāo)濃度，如100 aM和1 fM。然而，單獨(dú)使用RPA法則無法實(shí)現(xiàn)這種區(qū)分。這說明R-CASTI系統(tǒng)比RPA法具有更高的檢測靈敏度（圖4d）

作者探究了R-CASTI系統(tǒng)在多重核酸檢測中的可行性。作者首先優(yōu)化了activator的濃度（6 nM），然后，使用R-CASTI系統(tǒng)在單管中同時檢測HPV 16和18。HPV 16和18的存在分別特異性地產(chǎn)生了FAM和Cy5熒光信號，且沒有產(chǎn)生非特異性熒光信號（圖5a）。通過檢測不同濃度的HPV 16和HPV 18下的FAM和Cy5熒光信號，作者確定了R-CASTI系統(tǒng)的LOD為1 aM（圖5b）。這一結(jié)果優(yōu)于或可與其他基于CRISPR/Cas的多重檢測系統(tǒng)相媲美，這證實(shí)了R-CASTI系統(tǒng)在多重核酸檢測中的高靈敏度。最后，作者使用3種細(xì)胞系（Jurkat：HPV16-/18-；CaSki：HPV16+/18-；和HeLa：HPV16-/18+）來驗(yàn)證R-CASTI對人類基因組DNA（gDNA）中高危HPVs的有效檢測。結(jié)果顯示，Jurkat細(xì)胞系沒有出現(xiàn)FAM或Cy5信號，CaSki細(xì)胞系只產(chǎn)生FAM信號，HeLa細(xì)胞系只產(chǎn)生Cy5信號（圖5c）。上述檢測結(jié)果與核酸檢測的金標(biāo)準(zhǔn)qPCR的檢測結(jié)果一致，證實(shí)了R-CASTI系統(tǒng)的可靠性（圖5d）。