DNA甲基化檢測（重亞硫酸鹽處理）試劑盒

       DNA甲基化是一種基本的表觀遺傳學修飾，在基因表達調控、發(fā)育調節(jié)、基因組印跡等方面發(fā)揮重要作用。在DNA甲基轉移酶的催化下，CpG雙核苷的胞嘧啶第5 位碳原子被選擇性地添加甲基基團。 在人類腫瘤中，普遍發(fā)生甲基化異常的現(xiàn)象，由于甲基化與胚胎發(fā)育、細胞周期調控相關，因此DNA甲基化狀態(tài)的變化可作為疾病診斷和預后的一個有用的指示器。

       最早在1970年，重亞硫酸鹽轉化就被用于鑒別DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶（5-mC）?，F(xiàn)在認為在重亞硫酸鹽處理過程中，5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）都不會發(fā)生堿基的變化，因此這種方法不能用來區(qū)別不同的甲基化修飾。在重亞硫酸鹽轉化過程中，DNA首先用重亞硫酸鈉處理，在高溫和低pH條件下，將變性DNA（單鏈DNA）中的胞嘧啶轉化為胞嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物，這個反應是可逆的；接下來胞嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物發(fā)生不可逆的水解脫氨基過程，形成尿嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物。最后在高pH條件下尿嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物脫磺酸基形成尿嘧啶。只有未甲基化的胞嘧啶在重亞硫酸鹽處理下發(fā)生堿基變化， 5-mC和5-hmC仍然保持不變。轉化處理后的DNA經PCR擴增，尿嘧啶（U）轉變?yōu)樾叵汆奏ぃ?span style=";padding: 0px;font-size: 15px;border: 0px;outline: 0px;list-style-type: none;font-style: inherit;vertical-align: middle;text-align: center;line-height: 32px">T）。重亞硫酸鹽轉化示意圖如下：

圖1 重亞硫酸鹽處理將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶

       Active motif公司的Bisulfite Conversion Kit提供優(yōu)化的轉化試劑、簡單易用的操作步驟以及陽性對照PCR引物，簡化了DNA甲基化檢測的過程。整個轉化可在1.5小時之內完成，轉化效率高達99%。試劑盒提供轉化特異性PCR引物，可用于測序前驗證重亞硫酸鹽轉化效率。陽性對照PCR引物適用于重亞硫酸鹽轉化處理的人和小鼠DNA，經PCR擴增可得到220 bp的產物。

Active motif同時也提供MethylDetector™重亞硫酸鹽修飾試劑盒，該試劑盒是Active motif公司最初提供的一款DNA甲基化檢測試劑盒，原理和Bisulfite Conversion Kit一樣，但轉化時間需要5小時。

圖2 Bisulfite Conversion Kit 操作流程

使用Bisulfite Conversion Kit，將目的DNA用蛋白酶K處理，加入重亞硫酸鹽轉化試劑和DNA變性劑，在溫度循環(huán)儀中進行快速熱變性。經過1.5小時的DNA轉化反應，樣品加入到試劑盒里的DNA純化柱，脫鹽后洗脫DNA，可用于PCR或其他的下游實驗。

圖3 陽性對照轉化特異性PCR引物可用于特異性擴增轉化后的人和小鼠DNA

使用Bisulfite Conversion Kit處理人（A）和小鼠（B）基因組DNA，處理（Bis）和未處理（Untr）的DNA分別用陽性對照轉化特異性PCR引物進行PCR擴增分析。陽性對照PCR引物專門適用于經重亞硫酸鹽轉化的DNA，因此會擴增出220bp的條帶，而未處理的DNA沒有擴增出相應條帶。