DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（熒光型）使用說明書

（貨號：WLE8202KIT）

原理概述：

本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復(fù)合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結(jié)合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點(diǎn)形成D-loop區(qū)域，并開始對DNA雙鏈進(jìn)行掃描；待找到與引物互補(bǔ)的目的區(qū)域后，復(fù)合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結(jié)合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。本試劑盒在39 ºC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據(jù)模版設(shè)計的特異的分子探針，使用熒光監(jiān)測設(shè)備能實現(xiàn)對目標(biāo)片段擴(kuò)增過程的實時監(jiān)控。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

本試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時間短（僅需20 mins）等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分為干粉狀態(tài)，操作簡便，易于保存。

可適用于各種品牌的熒光定量PCR儀、恒溫?zé)晒鈹U(kuò)增儀器等熒光檢測設(shè)備。

引物設(shè)計：

建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度；引物設(shè)計避免形成二級結(jié)構(gòu)而影響擴(kuò)增；擴(kuò)增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。

熒光探針設(shè)計：

探針序列不與特異性引物識別位點(diǎn)重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基。探針共有四個修飾位點(diǎn)：距離5’端的≥35 nt的中部位置標(biāo)記一個dSpacer（，THF），作為核酸外切酶的識別位點(diǎn)；THF位點(diǎn)的上游標(biāo)記一個熒光基團(tuán)，下游標(biāo)記一個粹滅基團(tuán)，兩個基團(tuán)的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標(biāo)記一個修飾基團(tuán)，例如胺基、磷酸基團(tuán)或C3-Spacer。

試劑盒組成：

試劑盒儲存：

運(yùn)輸條件：低溫運(yùn)輸；

儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 ºC，避光保存，避免重壓、反復(fù)凍融；

產(chǎn)品有效期：12個月。

操作步驟：提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。

1)    每個干粉反應(yīng)管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需*融化混勻，否則會對實驗效果產(chǎn)生影響）；

2)    每個反應(yīng)管分別加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應(yīng)、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應(yīng)管中）；

3)    向反應(yīng)管中依次加入11.5 μL ddH₂O和2 μL核酸模板（可根據(jù)核酸濃度調(diào)整加入的核酸模板體積，并相應(yīng)調(diào)整加入的ddH₂O體積，至模板與ddH₂O總體積為13.5 μL）；

4)    zui后向反應(yīng)管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（對于多個反應(yīng)，建議將B buffer加至反應(yīng)管的蓋子內(nèi)側(cè)，上下顛倒反應(yīng)管8-10次混勻）；

5)    混勻后，將反應(yīng)液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應(yīng)管放入熒光檢測設(shè)備中。熒光檢測程序設(shè)置為：恒溫39 ºC；每30 s采集一次FAM通道（信號采集通道的選擇與熒光探針設(shè)計一致）熒光值；反應(yīng)時間20 mins。

注：如使用ABI系列PCR儀，請務(wù)必于passive reference和quencher處均選擇“none”。

體系配制                             正對照熒光結(jié)果圖

*正對照反應(yīng)單元體系配制：正對照模板加入2μL，引物與探針加入4.6 μL正對照引物探針Mix（已包含探針和上/下游引物），其他組分參照體系配制。

注意事項：

1．  由于試劑盒靈敏度非常高，在進(jìn)行反應(yīng)時請注意避免微量核酸污染，并盡量考慮設(shè)置空白對照以確認(rèn)是否有核酸污染。

2．  試劑盒保質(zhì)期12個月。每次使用時，請取出實驗所需的MIRA反應(yīng)單元的數(shù)量，置于冰浴條件下并在8小時內(nèi)使用；剩余部分，請置于存儲條件下。