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胱天蛋白酶在細(xì)胞凋亡和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。caspase-3（CPP32 / apopain）的激活對(duì)于凋亡的啟動(dòng)很重要。半胱天冬酶3也被鑒定為藥物篩選靶標(biāo)。半胱天冬酶3具有對(duì)肽序列Asp-Glu-Val-Asp（DEVD）的底物選擇性。該Amplite™Caspase-3分析試劑盒使用Ac-DEVD-AMC作為檢測(cè)caspase-3活性的熒光指示劑。AMC衍生的caspase底物被廣泛用于各種caspase活性的熒光檢測(cè)。通過(guò)胱天蛋白酶對(duì)AMC肽的切割產(chǎn)生強(qiáng)熒光的AMC，其在340-350nm的激發(fā)下在440-460nm下用熒光法監(jiān)測(cè)。該試劑盒可用于使用熒光酶標(biāo)儀或熒光計(jì)連續(xù)測(cè)量細(xì)胞提取物和純化的酶制劑中caspase-3的活性。
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 350納米 |
| 發(fā)射 | 450納米 |
| 隔斷 | 420納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
| 組分A：Caspase 3/7底物（200X儲(chǔ)備液） | 1小瓶（250 µL） |
| 組分B：測(cè)定緩沖液 | 1瓶（50毫升） |
| 成分C：DTT（1M） | 1小瓶（600 µL） |
| 組分D：Ac-DEVD-CHO（胱天蛋白酶3/7抑制劑） | 1個(gè)小瓶 |
用測(cè)試化合物準(zhǔn)備細(xì)胞（對(duì)于96孔板是100 µL /孔，對(duì)于384孔板是25 µL /孔）
加入等體積的Caspase 3/7分析工作溶液
在室溫下孵育1小時(shí)
監(jiān)測(cè)Ex / Em = 350/450 nm的熒光強(qiáng)度
重要說(shuō)明
使用前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鼋M分A，B，C（如果需要，請(qǐng)解凍組分D）。
儲(chǔ)備溶液的制備
除非另有說(shuō)明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
（可選）Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO儲(chǔ)備液（1 mM）：
直接向Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO（組分D）小瓶中添加100 µL DMSO（未提供）。該抑制劑可用于確認(rèn)熒光信號(hào)強(qiáng)度與Caspase 3/7樣蛋白酶活性之間的相關(guān)性。
準(zhǔn)備工作溶液
將50μL的200X Caspase 3/7底物原液（組分A）和100μL的1M DTT溶液（組分C）加入10 mL的測(cè)定緩沖液（組分B）中并充分混合。注意： 50μL的200X Caspase 3/7底物儲(chǔ)備液足以進(jìn)行100次測(cè)定，每次測(cè)定的反應(yīng)體積為100μL。遠(yuǎn)離光線。
程序
通過(guò)在PBS或所需緩沖液中加入10 µL 10X測(cè)試化合物（96孔板）或5 µL 5X測(cè)試化合物（384板）來(lái)處理細(xì)胞。對(duì)于空白孔（沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)基），添加相應(yīng)量的化合物緩沖液。
將細(xì)胞板在37°C，5％CO 2培養(yǎng)箱中孵育所需的時(shí)間（對(duì)于xishujian處理過(guò)的Jurkat細(xì)胞，需要4-6小時(shí)）以誘導(dǎo)凋亡。
加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Caspase 3/7工作溶液。
在避光的條件下，在室溫下孵育平板至少1小時(shí)。注意：如果需要，可在室溫下添加測(cè)定溶液*分鐘，向選定的樣品中加入1 µL Caspase 3/7抑制劑Ac-DEVD-CHO的1 mM儲(chǔ)備液，以確認(rèn)caspase 3/7樣蛋白酶的活性。
制動(dòng)關(guān)閉，以800 rpm離心細(xì)胞板（特別是非粘附細(xì)胞）2分鐘。
在Ex / Em = 350/450 nm處監(jiān)測(cè)熒光增加。
13502 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒 *藍(lán)色熒光* Amplite™ Fluorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Blue Fluorescence* 500 Tests 13503 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Fluorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Green Fluorescence* 500 Tests 13504 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Fluorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Red Fluorescence* 100 tests 13507 Amplite™熒光法Caspase 3/7活性檢測(cè)試劑盒 *黃色熒光* Amplite™ Colorimetric Caspase 3/7 Assay Kit *Yellow Color* 200 Tests 13510 Amplite™熒光法通用型基質(zhì)金屬蛋白酶MMP活性檢測(cè)試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit *Green Fluorescence* 1 kit 13511 Amplite™熒光法通用型基質(zhì)金屬蛋白酶MMP活性檢測(cè)試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Universal Fluorimetric MMP Activity Assay Kit *Red Fluorescence* 1 kit 13512 Amplite™熒光法基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-3活性檢測(cè)試劑盒 *綠色熒光* Amplite™ MMP-3 Activity Assay Kit *Green Fluorescence* 1 kit
