fumeiA（CoA）在所有形式的細胞生命中都是通用且*的輔因子，在許多生物合成，產(chǎn)生能量和降解的途徑中充當(dāng)主要的?；d體。它在脂肪酸的合成和氧化，丙酮酸的氧化和檸檬酸循環(huán)中起重要作用。CoA的測量是研究許多生物系統(tǒng)中生物過程和事件的基本任務(wù)之一。有幾種試劑或測定試劑盒可用于定量生物系統(tǒng)中的CoA含量。但是，現(xiàn)有的商用套件要么缺乏靈敏度，要么具有繁瑣的程序。我們的Amplite™熒光CoA定量分析試劑盒提供了一種超靈敏的熒光分析方法，可通過檢測CoA中的-SH基團來定量CoA含量。試劑盒中使用的我們專有的熒光CoA Green™染料在與-SH反應(yīng)時會發(fā)出強烈的熒光。該分析試劑盒在100 µL分析體積（40 nM）中僅能檢測到4 piCoole。它可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進行，無需分離步驟即可輕松實現(xiàn)自動化。

1. 準(zhǔn)備CoA標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50 µL）

2. 加入CoA工作溶液（50 µL）

3. 在室溫下孵育10分鐘-1小時

4. 監(jiān)視Ex / Em = 490/520 nm處的熒光增加

重要說明
開始實驗之前，請在室溫下解凍所有試劑盒組件。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1. CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mM）：
將200 µL ddH ₂ O加入CoA標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶（組分C）中，制成1 mM（1 nmol / µL）儲備液。注意：強烈建議使用充滿氮氣的ddH ₂ O除去氧氣，以制備fumeiA標(biāo)準(zhǔn)溶液。水溶液不穩(wěn)定，會迅速降解。應(yīng)將其保存在2-8°C并在一天之內(nèi)使用。

2. CoA Green™儲備溶液（100X）：
將100 µL DMSO（組分D）添加到CoA Green™（組分A）小瓶中，制成100X儲備溶液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計

將30 µL CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到970 µL測定緩沖液（組分B）中，以生成30 µM（30 pmol / µL）CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液。取30 µM CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液（CoA7），用測定緩沖液（組分B）進行1：3連續(xù)稀釋，以獲得CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液（CoA1-CoA6）的連續(xù)稀釋液。注意：稀釋的CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時內(nèi)使用。

準(zhǔn)備工作溶液

將50μL的CoA Green™儲備溶液（100X）加入5 mL的測定緩沖液（組分B）中并充分混合。

程序

表1.黑色96孔微孔板中CoA標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。CoA =fumeiA標(biāo)準(zhǔn)品（CoA1-CoA7，0.03至30 µM）；BL =空白對照；TS =測試樣品。

表2。每個孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和2中提供的布局，準(zhǔn)備fumeiA標(biāo)準(zhǔn)品（CoA），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。
   

2. 將50 µL CoA工作溶液添加到CoA標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個孔中，以使總CoA分析體積為100 µL /孔。對于384孔板，請向每個孔中添加25 µL CoA工作溶液，總體積為50 µL /孔。
   

3. 避光保存，室溫下孵育反應(yīng)10分鐘至1小時。
   

4. 使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 490/520 nm處的熒光增加。

數(shù)據(jù)分析

1e+41000100101010.1- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Coenzyme A (uM)RFUX: 0.0188Hover mouse to interactY: 2.995Y: 2.995

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計算fumeiA樣品。