會(huì)員.png)
6
fumeiA（CoA）在所有形式的細(xì)胞生命中都是通用且*的輔因子，在許多生物合成，產(chǎn)生能量和降解的途徑中充當(dāng)主要的酰基載體。它在脂肪酸的合成和氧化，丙酮酸的氧化和檸檬酸循環(huán)中起重要作用。CoA的測量是研究許多生物系統(tǒng)中生物過程和事件的基本任務(wù)之一。有幾種試劑或測定試劑盒可用于定量生物系統(tǒng)中的CoA含量。但是，現(xiàn)有的商用套件要么缺乏靈敏度，要么具有繁瑣的程序。我們的Amplite™熒光CoA定量分析試劑盒提供了一種超靈敏的熒光分析方法，可通過檢測CoA中的-SH基團(tuán)來定量CoA含量。試劑盒中使用的我們專有的熒光CoA Green™染料在與-SH反應(yīng)時(shí)會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。該分析試劑盒在100 µL分析體積（40 nM）中僅能檢測到4 piCoole。它可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式進(jìn)行，無需分離步驟即可輕松實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 490納米 |
| 發(fā)射 | 520納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
| 組件A：CoA Green™ | 1個(gè)小瓶 |
| 組分B：測定緩沖液 | 1瓶（25毫升） |
| 組分C：fumeiA（CoA）標(biāo)準(zhǔn)品（FW = 767.53） | 1小瓶（154微克） |
| 成分D：DMSO | 1小瓶（200 µL） |
準(zhǔn)備CoA標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品（50 µL）
加入CoA工作溶液（50 µL）
在室溫下孵育10分鐘-1小時(shí)
監(jiān)視Ex / Em = 490/520 nm處的熒光增加
重要說明
開始實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)?jiān)谑覝叵陆鈨鏊性噭┖薪M件。
儲(chǔ)備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1. CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mM）：
將200 µL ddH 2 O加入CoA標(biāo)準(zhǔn)樣品瓶（組分C）中，制成1 mM（1 nmol / µL）儲(chǔ)備液。注意：強(qiáng)烈建議使用充滿氮?dú)獾膁dH 2 O除去氧氣，以制備fumeiA標(biāo)準(zhǔn)溶液。水溶液不穩(wěn)定，會(huì)迅速降解。應(yīng)將其保存在2-8°C并在一天之內(nèi)使用。
2. CoA Green™儲(chǔ)備溶液（100X）：
將100 µL DMSO（組分D）添加到CoA Green™（組分A）小瓶中，制成100X儲(chǔ)備溶液。
配制標(biāo)準(zhǔn)溶液
為了方便起見，請(qǐng)使用我們的系列稀釋計(jì)
將30 µL CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到970 µL測定緩沖液（組分B）中，以生成30 µM（30 pmol / µL）CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液。取30 µM CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液（CoA7），用測定緩沖液（組分B）進(jìn)行1：3連續(xù)稀釋，以獲得CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液（CoA1-CoA6）的連續(xù)稀釋液。注意：稀釋的CoA標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定，應(yīng)在4小時(shí)內(nèi)使用。
準(zhǔn)備工作溶液
將50μL的CoA Green™儲(chǔ)備溶液（100X）加入5 mL的測定緩沖液（組分B）中并充分混合。
程序
表1.黑色96孔微孔板中CoA標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品的布局。CoA =fumeiA標(biāo)準(zhǔn)品（CoA1-CoA7，0.03至30 µM）；BL =空白對(duì)照；TS =測試樣品。
| BL | BL | TS | TS |
| CoA1 | CoA1 | ... | ... |
| fumeiA2 | fumeiA2 | ... | ... |
| CoA3 | CoA3 | ||
| CoA4 | CoA4 | ||
| CoA5 | CoA5 | ||
| CoA6 | CoA6 | ||
| CoA7 | CoA7 |
表2。每個(gè)孔的試劑組成。
| 好 | 體積 | 試劑 |
| CoA1-CoA7 | 50微升 | 連續(xù)稀釋（0.03至30 µM） |
| BL | 50微升 | 分析緩沖液（組分B） |
| TS | 50微升 | 樣品 |
根據(jù)表1和2中提供的布局，準(zhǔn)備fumeiA標(biāo)準(zhǔn)品（CoA），空白對(duì)照（BL）和測試樣品（TS）。對(duì)于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。
將50 µL CoA工作溶液添加到CoA標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照和測試樣品的每個(gè)孔中，以使總CoA分析體積為100 µL /孔。對(duì)于384孔板，請(qǐng)向每個(gè)孔中添加25 µL CoA工作溶液，總體積為50 µL /孔。
避光保存，室溫下孵育反應(yīng)10分鐘至1小時(shí)。
使用熒光板讀數(shù)器監(jiān)測Ex / Em = 490/520 nm處的熒光增加。
數(shù)據(jù)分析
1e+41000100101010.1- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Coenzyme A (uM)RFUX: 0.0188Hover mouse to interactY: 2.995Y: 2.995
從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對(duì)照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程式可用于計(jì)算fumeiA樣品。
| 15265 | ReadiUse™即用型NADPH再生回收試劑盒 | ReadiUse™ NADPH Regenerating Kit | 1 kit |
| 15266 | ReadiUse™即用型NADP再生回收試劑盒 | ReadiUse™ NADP Regenerating Kit | 1 kit |
| 15270 | Amplite™熒光法fumeiA定量試劑盒*綠色熒光* | Amplite™ Fluorimetric Coenzyme A Quantitation Kit *Green Fluorescence* | 200 Tests |
| 15271 | Amplite™比色法NADH檢測試劑盒 | Amplite™ Colorimetric NADH Assay Kit | 400 Tests |
| 15272 | Amplite™比色法NADPH檢測試劑盒 | Amplite™ Colorimetric NADPH Assay Kit | 400 Tests |
