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酯酶催化的太陽紅醋酸鹽（SRA）水解產(chǎn)生太陽紅熒光團，可以用633 nm激光激發(fā)，發(fā)射出約660 nm的熒光。使用大多數(shù)商業(yè)熒光儀器通常配備的Cy5濾光片套件，可以輕松檢測到Sun Red的熒光。盡管太陽紅很容易在633 nm處激發(fā)，發(fā)出約660 nm的紅色光，但SRA在633 nm處具有極小的吸收而無紅色發(fā)射，這使SRA成為敏感的NIR酯酶底物之一。SRA為細(xì)胞活力測定提供了第二種顏色，而流行的熒光素顏色可以用于另一種細(xì)胞功能測定。SRA是一種非熒光疏水化合物，可以穿過細(xì)胞膜，隨后細(xì)胞內(nèi)酯酶水解乙酸酯基團，產(chǎn)生高熒光產(chǎn)物Sun Red。太陽紅分子在具有完整膜的細(xì)胞中積累，因此深紅色熒光可以用作細(xì)胞活力的標(biāo)志。不具有完整細(xì)胞膜或活躍代謝的細(xì)胞可能不會積聚熒光產(chǎn)物，因此不會顯示深紅色熒光。SRA可以與綠色活體染色劑（例如FITC或Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗體）結(jié)合使用。
| 熒光顯微鏡 | |
| 激發(fā) | 620納米 |
| 發(fā)射 | 660海里 |
| 推薦板 | 黑墻/透明底 |
| 儀器規(guī)格 | Cy5濾光片組 |
| 熒光酶標(biāo)儀 | |
| 激發(fā) | 620納米 |
| 發(fā)射 | 660海里 |
| 隔斷 | 640納米 |
| 推薦板 | 純黑色 |
- 用測試化合物準(zhǔn)備細(xì)胞
- 取出介質(zhì)
- 添加SunRed™醋酸鹽工作溶液（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）
- 在5％CO 2培養(yǎng)箱中于37°C 孵育1小時
- 用HHBS清洗并更換工作溶液
- 在Ex / Em = 620/660 nm處讀取熒光強度（截止640 nm）
重要說明
以下是推薦的協(xié)議。它僅提供一個準(zhǔn)則，應(yīng)根據(jù)具體需要進行修改。
儲備溶液的制備
除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，制備后應(yīng)儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。
1. SunRed™醋酸鹽原液（2至10 mM）
準(zhǔn)備2至10 mM的SunRed™醋酸鹽在DMSO中的原液。儲備溶液應(yīng)及時使用。
SunRed™醋酸鹽工作溶液：
在實驗之前，在具有20 mM Hepes緩沖液（HHBS）或您選擇的緩沖液的1X Hank鹽溶液中準(zhǔn)備5至10 µM的SunRed™醋酸鹽工作溶液。
程序
- 從細(xì)胞中除去培養(yǎng)基。
- 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的SunRed™醋酸鹽工作溶液。
- 在避光的情況下，在室溫或37°C下將SunRed™醋酸鹽工作溶液板孵育1小時。合適的孵育時間取決于所用的單個細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度。優(yōu)化每個實驗的孵育時間。對于非貼壁細(xì)胞，建議在孵育后以800 rpm的速度離心細(xì)胞板2分鐘，然后制動。
- 在Ex / Em = 620/660 nm（截止640 nm）下監(jiān)測熒光強度。
11410 Amplite™ 比色法腸激酶活性檢測試劑盒 Amplite™ Colorimetric Enterokinase Activity Assay Kit 200 Tests 11500 Amplite™ 比色法過氧化氫檢測試劑盒 Amplite™ Colorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit 500 Tests 11501 Amplite™熒光法過氧化氫檢測試劑盒 *紅色熒光* Amplite™ Fluorimetric Hydrogen Peroxide Assay Kit *Red Fluorescence* 500 Tests
