SuperSep Phos-tag™ 是研究蛋白磷酸化的方法，無需特異性磷酸化抗體或者同位素標(biāo)記。

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◆SuperSep Phos-tag™

　　Phos-tag™ 是一種預(yù)制膠，預(yù)先加入了 50 μmol/L 的 Phostag™ Acrylamide，打開包裝即可直接使用。預(yù)制膠中含有鋅作為金屬離子，在中心凝膠緩沖液中保存穩(wěn)定性很好，得到的帶條結(jié)果也很整齊。

　　磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白作為不同條帶分離。

　　分離后，膠可用于考馬斯亮藍(lán)染色，免疫印跡和質(zhì)譜實驗。

已公開的驗證蛋白列表，請點擊

◆Phos-tag™ SDS-PAGE 的原理

◆在 HighWire Search 上搜索到的論文數(shù)

◆運用

利用 p35 的bingansuan突變體確定 Cdk5 激活 p35 的磷酸化位點

　　p35 常見的磷酸化位點是 Ser8 和 Thr138。但是 Ser8 和 Thr138 位點往往會發(fā)生bingansuan突變，產(chǎn)生３種突變體（Ser8 突變體：S8A，Thr138 突變體：T138A，Ser8 和 Thr138 雙突變體：2A）。這３種突變體、野生型 p35、Cdk5 和沒有激酶活性的 Cdk5 都來源于 COS-7 細(xì)胞。這些細(xì)胞裂解液用Phos-tag™ SDS-PAGE 和 Western blotting 進(jìn)行檢測（檢測抗體：p35 抗體）。

100 μM Phos-tag ™ 丙烯酰胺, 7.5% 聚丙烯酰胺凝膠

可明確磷酸化位點和條帶遷移率的關(guān)系！

- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道５（條帶 M1）：p35 在 Cdk5 的作用下發(fā)生了磷酸化；

- 泳道１（條帶 L2 和 L4）和泳道３（條帶 L2 和 L4）：在無激酶活性 Cdk5 的作用下，大約有一半 p35 蛋白在 Thr138 位點發(fā)生磷酸化，同樣在 138 位發(fā)生突變的 p35 蛋白亦是如此。

- 泳道５ （條帶 M1）和泳道６（條帶 L3 和 L4）：Ser8 和 Thr138 是主要的磷酸化位點；

- 泳道５（條帶 M1）、泳道７（條帶L1和L2）和泳道８（條帶M2）：條帶 M1 是 Ser8 和T hr138 都發(fā)生磷酸化的條帶；

條帶 M2 是只有 Ser8 磷酸化的條帶；條帶 L1 和 L2 是只有 Thr138 磷酸化的條帶。

※ 條帶 L1 和 L3 中的Ｘ是不確定哪個位點發(fā)生磷酸化的條帶；

※ 條帶L4是非磷酸化的 p35 。

【參考文獻(xiàn)】

? Quantitative Measurement of in Vivo Phosphorylation States of Cdk5 Activator p35 by Phos-tag ™ SDS-PAGE. T. Hosokawa, T. Saito, A. Asada, K. Fukunaga, and S. Hisanaga,Mol. Cell. Proteomics, Jun 2010;9: 1133 - 1143.

【結(jié)果提供】

理化學(xué)研究所 腦科學(xué)綜合研究中心 回路功能研究核心 記憶功能研究團(tuán)隊 細(xì)川智永（Dr. T. Hosokawa）

首都大學(xué)東京 理工學(xué)研究科 生命科學(xué)專業(yè) 神經(jīng)分子功能研究室 久永真市（Dr. S. Hisanaga）

檢測含有 Dnmt1 磷酸化激酶的片段

我們可以確定在片段中含有目的激酶！

① 采用親和色譜法從鼠腦提取液中純化 GST-Dnmt1（1-290）結(jié)合蛋白

② 使用 0.3 M 和 1 M NaCl 的 DNA 纖維素柱洗脫得到目的蛋白

③ GST-Dnmt1（1-290）作為體外激酶實驗的反應(yīng)底物

④ Phos-tag ™ SDS-PAGE 用于Western blotting，確定遷移條帶中每個片段的激酶活性

【參考文獻(xiàn)】

The DNA-binding activity of mouse DNA methyltransferase 1 is regulated by phosphorylation with casein kinase 1delta/epsilon. Y. Sugiyama, N. Hatano, N. Sueyoshi, I. Suetake, S. Tajima, E. Kinoshita, E. Kinoshita-Kikuta, T. Koike, and I. Kameshita, Biochem. J., May 2010; 427(3): 489-97.

【結(jié)果提供】

高知大學(xué) 綜合研究中心 生命、功能物質(zhì)部門 實驗實習(xí)機(jī)器設(shè)施 杉山康憲（Dr. Y. Sugiyama）

香川大學(xué) 農(nóng)學(xué)部 應(yīng)用生物科學(xué)科 動物功能生化學(xué)研究室 龜下勇（Dr. I. Kameshita）

二維電泳中的應(yīng)用：分析 hnRNP K 磷酸化異構(gòu)體

　　小鼠巨噬細(xì)胞 J774.1 經(jīng) LPS 刺激后，裂解細(xì)胞，經(jīng)過免疫沉淀法分離得到 hnRNP K。在二維電泳中，一維是 IPG 膠，二維是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分離 hnRNP K 的異構(gòu)體。利用質(zhì)譜儀，可以確認(rèn)不同的點代表不同的亞型或修飾蛋白。

同一個等電點的位置上，不同位點發(fā)生磷酸化都可以被區(qū)分開來

（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【參考文獻(xiàn)】

? Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics, Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【結(jié)果提供】

橫濱市立大學(xué) 生命納米系統(tǒng)科學(xué)研究科 生物體超分子系統(tǒng)科學(xué)專業(yè) 木村彌生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）

理化學(xué)研究所 RCAI 小原收

◆備注

樣品制備：

Phos-tag SDS-PAGE 對于蛋白樣品中的雜質(zhì)非常敏感，尤其是螯合劑，釩酸，無機(jī)鹽，表面活性劑這類物質(zhì)。

強(qiáng)烈建議在 Phos-tag SDS-PAGE 之前通過 TCA 沉淀或滲析法降低雜質(zhì)含量。

轉(zhuǎn)膜前處理：

另一個必須的步驟是在轉(zhuǎn)膜前，用 EDTA 去除凝膠中的金屬離子（Mn²⁺ 或者Zn²⁺）；該步驟可提高蛋白的轉(zhuǎn)膜效率。

●　分別準(zhǔn)備 10 mmol/L 含 EDTA 和不含 EDTA 兩種 1x transfer buffer。

●　將凝膠浸泡在含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，至少 20 分鐘，溫和搖晃。更換新緩沖液，重復(fù)３次。

●　將凝膠浸泡在不含 10 mmol/L EDTA 的 1x transfer buffer，10 分鐘，溫和搖晃。

●　轉(zhuǎn)膜操作*。

* 建議用濕法轉(zhuǎn)膜，以提高轉(zhuǎn)膜效率。

◆質(zhì)量控制

　　每一批 SuperSep Phos-tag™，出廠前均根據(jù)其產(chǎn)品規(guī)格進(jìn)行測試，以保證可分離磷酸化和非磷酸化蛋白，以及他們的分離成都在正常參數(shù)內(nèi)。

◆保存溫度

2-10℃

◆產(chǎn)品信息

用于 Bio-Rad 伯樂電泳儀

用于 Life Technologies 電泳儀

用于 Wako EasySeperator 電泳儀

◆相關(guān)產(chǎn)品