Cas9 High Yield sgRNA Synthesis and Purification Kit 是基于 T7 RNA 聚合酶的體外 RNA 轉(zhuǎn)錄試劑盒，可高效進行 Cas9 sgRNA 的制備。使用本試劑盒時，僅需按照本試劑盒說明書設計并合成 Target Sense Oligo，每次反應可獲得 50-150 μg 的 Cas9 sgRNA。獲得的 Cas9 sgRNA 可應用于 CRISPR 分子診斷、基因編輯等。

產(chǎn)品組分

a. Cas9 Control Target Sense Oligo 是陽性對照，可與 Cas9 Antisense Oligo 退火延伸后，作為轉(zhuǎn)錄模板使用，用來測試體外轉(zhuǎn)錄體系的效率。在 37℃孵育 30 min 條件下，對照轉(zhuǎn)錄反應體系生成的 sgRNA 產(chǎn)量≥50 μg，其產(chǎn)量在純化后由NanoDrop 測定。在變性條件下進行 TBE-Urea gel 電泳，可觀察到 sgRNA 單條帶大小約為 100 nt。

b. 本產(chǎn)品中 Part B 組分（純化磁珠，#3620F）與 Part A 組分保存條件不同，因此 Part B 組分需單獨運輸！

保存條件

Part A 組分-20℃保存,有效期 1 年。

需自備的實驗物品

PCR 儀

無水乙醇

異丙醇

無核酸酶水

96 孔磁力架

96 孔板或 PCR 8 聯(lián)排管

移液器及吸頭

Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄引物設計

1.Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖如圖 1 所示,試劑盒中已提供 Cas9 Antisense Oligo,只需根據(jù)待測目標序列設計 Target Sense Oligo 即可。

圖 1. Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄原理示意圖

2.Target Sense Oligo 設計舉例

2.1 選取 20 bp 的 Target Sequence,其中方框部分為 PAM 序列,下劃線部分為 Target Sequence。

2.2 根據(jù)選取的 Target Sequence 設計 Target Sense Oligo,則其序列應為:

其中雙下劃線為保護堿基,波浪線部分為 T7 Promoter 序列,下劃線部分為 Target Sequence反向互補序列,如果 Target Sequence 反向互補序列第一個字母是 G 堿基,則可以和 T7 Promoter 序列共用一個 G 堿基。下劃虛線部分為 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。

2.3 轉(zhuǎn)錄得到的 Cas9 sgRNA 序列應為:

下劃線部分為 Target Sequence反向互補序列,波浪線部分為 SpCas9 sgRNA Scaffold 部分序列。

實驗流程

1.DNA 轉(zhuǎn)錄模板制備

Cas9 Antisense Oligo 與 Target Sense Oligo 退火延伸反應完成后便可作為轉(zhuǎn)錄模板使用。

1.1 退火體系配制

1.2 PCR 退火延伸程序設置

2.Cas9 sgRNA 體外轉(zhuǎn)錄

2.1 按下表試劑的順序進行反應體系的配制。

· 請將試劑解凍并混勻后再使用。

· 5 × TranscriptMax Reaction Buffer 中含有亞精胺,而亞精胺與核酸容易形成復合體沉淀,DNA 轉(zhuǎn)錄模板盡量最后加入到體系中。

· 上述反應體系的總體積為 20 μL,可適當?shù)缺壤{(diào)整反應體系。

2.2 將上述試劑充分混勻,然后短暫離心,在 37℃下孵育 0.5-1 h 進行體外轉(zhuǎn)錄。

2.3 37℃孵育結(jié)束后,按照下表配制 30 μL 的 DNase Ⅰ反應液加入到 20 μL 的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中,以去除轉(zhuǎn)錄體系中的 DNA 模板。

DNase Ⅰ反應條件:37℃,30 min。

3.Cas9 sgRNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物磁珠純化

3.1 首先將磁珠從 4℃冰箱中取出,在室溫中放置約 30 min,使其溫度平衡至室溫。顛倒或渦旋振蕩使磁珠充分混勻,吸取 25 μL 磁珠和 50 μL 異丙醇加入到 50 μL 待純化的 sgRNA 樣品中,用移液器吹打充分混勻。

3.2 室溫孵育 5 min,使 RNA 結(jié)合到磁珠上。

3.3 將樣品置于磁力架上 5 min,待溶液澄清后,小心移除上清。

3.4 保持樣品置于磁力架上,加入 200 μL 新鮮配制的 80%乙醇,漂洗磁珠,室溫孵育 30 s,小心移除上清。

注:漂洗時使用的 80% (v/v)乙醇需要使用 Nuclease-free water 新鮮配制,配制方法舉例如下:分別量取8 mL 無水乙醇和 2 mL Nuclease-free water,混勻后可得 10 mL 80% (v/v)乙醇。

3.5 重復步驟 4,共漂洗 2 次。

3.6 保持樣品始終處于磁力架上,開蓋空氣干燥磁珠 5 min。

注:磁珠開蓋晾干時要避免過分干燥,如果磁珠出現(xiàn)龜裂,則提示磁珠過分干燥,此時 RNA 的洗脫效率會降低。

3.7 將樣品從磁力架上取出,加入 50 μL Nuclease-free water,用移液器吹打以充分混勻,室溫靜置 5 min。

3.8 將樣品置于磁力架 5 min,待溶液澄清后,小心轉(zhuǎn)移上清至一個新的 Nuclease-free PCR 管中,即得到純化后的 Cas9 sgRNA。

注意事項

1. 本試劑盒制備的 sgRNA 為目前的 SpCas9 sgRNA,如果要制備其它類型的 Cas9 sgRNA,只需要根據(jù) Cas9 sgRNA scaffold 序列重新設計 Target Sense Oligo 與 Cas9 Antisense Oligo 即可。

2. 本試劑盒中的 Part B 組分(純化磁珠,#3620F)單獨運輸。磁珠保存條件為 2-8℃,嚴禁凍存和高速離心操作。

3. 轉(zhuǎn)錄模板的純度會顯著影響體外轉(zhuǎn)錄反應。例如模板 DNA 中混入 RNase、EDTA、NaCl 等高鹽溶液均可顯著抑制體外轉(zhuǎn)錄反應,導致 RNA 合成量減少。

4. 實驗過程應選用無核酸酶的槍頭和離心管。