正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定                                             

測(cè)定意義：

類黃酮是植物次生代謝產(chǎn)物，糖基化是類黃酮基本結(jié)構(gòu)形成的最主要的修飾反應(yīng)之一，提高了類黃酮苷元的化學(xué)穩(wěn)定性，這一過(guò)程主要由類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶催化的，使類黃酮-OH與UDPG反應(yīng)，是黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶。

測(cè)定原理：

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶催化花青素與尿苷二磷酸葡萄糖反應(yīng)產(chǎn)生花青苷，主要以矢車菊素3-葡萄糖苷（C3G）形式存在，用HPLC檢測(cè)產(chǎn)物可反映類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活性。

組成：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃避光保存。臨用前加全部試劑三溶解。

自備儀器和用品：

天平、研砵、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、100目篩、高校液相色譜、針頭過(guò)濾器（水系、0.22μm）、濾膜（水系、0.45μm）、耐水C18柱（4.6×250mm）、樣品瓶、甲酸、甲醇（色譜級(jí)）、超純水

酶液提取:

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：2~5的比例（建議稱取約0.5g組織，加入1ml提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作：

1、檢測(cè)產(chǎn)物制備

2、將500 ml超純水和500 ml甲醇用0.45 μm的濾膜抽濾，以除去溶劑中的雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱。（注：蒸餾水用水系濾膜抽濾，甲醇用有機(jī)系濾膜抽濾）。

3、流動(dòng)相的配制：流動(dòng)相A為1.6%甲酸水溶液； 流動(dòng)相B為1.6%甲酸甲醇溶液。

4、將配好的流動(dòng)相超聲30分鐘，以脫去溶劑中的氣泡，防止堵塞色譜柱。

5、標(biāo)準(zhǔn)品的配制：

在標(biāo)準(zhǔn)品中加入1ml甲醇，配成5μmol /ml 母液，將母液用甲醇分別稀釋成2μmol/ml ，1μmol/ml 、0.5μmol/ml 、0.25μmol/ml、0.125μmol/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。針頭式過(guò)濾器過(guò)濾后待測(cè)。

測(cè)定操作表：

1. 開啟電腦、檢測(cè)器和泵，安裝上色譜柱，打開軟件，在方法組中設(shè)置進(jìn)樣量10 μl，梯度洗脫為0~5min，85%A+15%B; 5~10min，85%A+15%B; 10~30min，80%A+20%B; 30~30.1min， 60%A+40%B; 30.1~40min，0%A+100%B。流速1ml/min，柱溫30℃，走樣時(shí)間為50min，檢測(cè)波長(zhǎng)530nm，設(shè)置完畢保存方法組。

2.初始設(shè)置流動(dòng)相A=85%，流動(dòng)相B=15%，流速1 ml/min，待基線穩(wěn)定后開始加樣。

3.加入標(biāo)準(zhǔn)品10 μl，在50min內(nèi)可分離C3G，C3G的保留時(shí)間在25min左右，（柱子不同，保留時(shí)間有差異），計(jì)算不同濃度的C3G標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。

4. 加入樣品10 μl，在相應(yīng)保留時(shí)間處檢測(cè)C3G的峰面積。

酶活計(jì)算：

1. 以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)計(jì)算C3G標(biāo)準(zhǔn)曲線。將樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品C3G含量。

2. 酶活單位定義：

A． 每毫克組織蛋白每分鐘催化反應(yīng)產(chǎn)生1μmolC3G定義為一個(gè)酶活單位。

UFGT活性（μmol/min/mg prot）= C×V反總÷（V樣×Cpr）÷ T=0.117×C÷Cpr                             

B． 每克組織每分鐘催化反應(yīng)產(chǎn)生1μmolC3G定義為一個(gè)酶活單位。

UFGT活性（μmol/min/g 鮮重）= C×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷ T=0.117×C÷W      

C：C3G濃度，μmol/ml ；V反總：反應(yīng)總體積，0.35ml；V樣：加入樣本量，0.1ml，V樣總：加入提取液體積，1ml，Cpr：蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g，T：反應(yīng)時(shí)間，min

注意事項(xiàng)：

1、流速由小到大調(diào)節(jié)，避免柱壓過(guò)大。

2、使用完畢時(shí)，先用50%的甲醇水溶液洗色譜柱45min，再用純甲醇沖洗色譜柱30min。

標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中C3G濃度確定，樣品中C3G的峰面積必須落在不同濃度的C3G標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之內(nèi)，該標(biāo)準(zhǔn)品稀釋倍數(shù)只是一個(gè)參考。