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閱讀：153發(fā)布時(shí)間：2023-1-17
反相色譜（RP-HPLC）是一種非常強(qiáng)大的分離模式，從小的有機(jī)酸到150 KDa的蛋白，它被應(yīng)用于無(wú)數(shù)化合物的分析分離工作中。但是反相色譜有一個(gè)局限，就是在分析水溶性好（也就是親水性強(qiáng)）的分析物時(shí)保留較弱，這時(shí)我們往往需要設(shè)計(jì)增加流動(dòng)相中水相的比例以增加極性分析物和疏水固定相之間的作用，從而增加極性化合物的保留。分析物的極性越大，流動(dòng)相中水的比例也需要更高。但是當(dāng)我們?cè)诩兯嗷蚪咏兯嗟牧鲃?dòng)相條件下長(zhǎng)時(shí)間使用常規(guī)C18時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)分析物的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生逐漸或者突然變小而出現(xiàn)結(jié)果不能重現(xiàn)的問(wèn)題。所以色譜研究人員經(jīng)常有以下的問(wèn)題：
“為什么純水條件下會(huì)發(fā)生這個(gè)現(xiàn)象？"
“流動(dòng)相中水的比例到底多高是可以接受的？"
“但是為什么又有一些C18固定相的反相色譜柱在純水條件下沒(méi)有保留時(shí)間減少的問(wèn)題？"
為什么純水條件下會(huì)發(fā)生這個(gè)現(xiàn)象？
對(duì)于常規(guī)的C18（或其他疏水固定相）色譜柱在99%水的流動(dòng)相中會(huì)逐漸或突然減少分析物的保留時(shí)間這個(gè)現(xiàn)象，早期的解釋是鍵合在硅膠表面的C18固定相在純水條件下的改變了C18的空間排布，即由原來(lái)的垂直在硅膠表面變成了平躺在硅膠的表面，也就是常說(shuō)的“固定相塌陷"（Phase collapse），如圖1。固定相平躺在硅膠表面就減少了固定相和分析物之間的作用，分析物的保留時(shí)間也就因此減少。
圖1 (a)在水/甲醇中的固定相狀態(tài)；(b)純水相中的固定相狀態(tài)
到了90年代的后期，實(shí)驗(yàn)證據(jù)的出現(xiàn)讓許多研究者接受了另一種新的理論解釋?zhuān)簿褪潜Ａ魰r(shí)間的減少實(shí)際是由于固定相的顆?？住?/span>去濕“（Dewetting）現(xiàn)象所造成。也就是說(shuō)水相和疏水的固定相表面之間產(chǎn)生高的表面張力，因此流動(dòng)相會(huì)很容易被逐出布滿(mǎn)疏水固定相的填料的多孔空間。如果顆粒的孔內(nèi)不再有液體，固定相和分析物相互接觸的機(jī)會(huì)也減少了，進(jìn)而造成兩者之間相互吸引力的減少，分析物的保留時(shí)間自然縮短。實(shí)驗(yàn)證實(shí)當(dāng)C18的固定相由高有機(jī)溶劑突然轉(zhuǎn)換99%水溶劑時(shí)，流動(dòng)相在色譜柱中的體積明顯的降低，而流動(dòng)相在色譜柱內(nèi)的體積減低的幅度和分析物的保留時(shí)間的減少有著密切關(guān)聯(lián)。
圖2 （a）“濕潤(rùn)"狀態(tài)；(b)“去濕"狀態(tài)
影響溶劑被逐出顆?？淄庥幸韵聨讉€(gè)主要因素：顆粒的孔徑大小，固定相的種類(lèi)，柱溫，以及柱壓（對(duì)于柱壓這個(gè)因素，我們也可以說(shuō)“去濕"與顆粒大小和流速有關(guān)）。Young和 Laplace的方程式（如下）經(jīng)常用來(lái)解釋不同參數(shù)影響去濕的現(xiàn)象。這個(gè)方程式提供了以下幾個(gè)參數(shù)的關(guān)系：進(jìn)入毛細(xì)管所需的壓力(P)，液體在表面接觸的角度(θ), 液體的表面張力(γ)，和毛細(xì)管的半徑(r)。
因?yàn)樗阪I合疏水固定相的硅膠表面接觸的角度大于90°，所以要將水?dāng)D進(jìn)到硅膠顆粒的孔中是需要正壓。在正常的液相分析中，將水推進(jìn)硅膠顆?？字械膲毫κ谴笥诹鲃?dòng)相經(jīng)過(guò)整支色譜柱硅膠表面所需的壓力。所以當(dāng)柱壓突然停止時(shí)，孔內(nèi)壓力大于孔外壓力，水的流動(dòng)相就自然由疏水固定相的顆?？變?nèi)被排出來(lái)。當(dāng)再使用這支色譜柱時(shí)而顆?？變?nèi)沒(méi)有液體時(shí)，固定相和分析物接觸的體積大大的減少，分析物的保留時(shí)間自然就很明顯的減少。但是當(dāng)固定相變得比較不疏水時(shí)，水和硅膠表面的接觸角度就會(huì)減少。一旦當(dāng)接觸角度小于90°, 由上面的方程式得到進(jìn)入毛細(xì)管所需的壓力（P）就成為負(fù)數(shù)，表示孔外壓力大于孔內(nèi)壓力，流動(dòng)相會(huì)自動(dòng)地進(jìn)入顆?？變?nèi)。這就是我們說(shuō)的“濕潤(rùn)"（wetting）顆?？住Ｉ厦娴姆匠淌揭餐瑫r(shí)告訴我們顆?？讖降拇笮。╮）也會(huì)影響到壓力，當(dāng)孔徑越小，要將流動(dòng)相推入孔內(nèi)所需要的壓力也就越大。
雖然上面方程式提供一個(gè)很好的理論解釋?zhuān)且驗(yàn)楣枘z孔的結(jié)構(gòu)并非很對(duì)稱(chēng)，顆粒大小也不是很均勻，而且孔內(nèi)的固定相也包含了沒(méi)有鍵合的游離硅醇基團(tuán)，不同密度的固定相（例如C18）和被封端的硅醇基團(tuán)（例如TMS封端）。所以當(dāng)我們希望準(zhǔn)確回答“流動(dòng)相中的水的比例到底多高是太高？"時(shí)，色譜方面的文獻(xiàn)往往無(wú)法給出具體的答案，但是它們給了我們非常有用的數(shù)據(jù)來(lái)判斷趨勢(shì)。比如 Bidlingmeyer 和 Broske發(fā)現(xiàn)對(duì)于一種常規(guī)的C18色譜柱，如果孔徑大小是80 ?時(shí)，在純水流動(dòng)相條件下保留時(shí)間大幅減少（約80%），而孔徑是150 ?時(shí)，對(duì)保留時(shí)間則沒(méi)有影響。如果是帶有苯基的固相相，即使是80 ?的孔徑，保留時(shí)間也毫無(wú)影響。
流動(dòng)相中水的比例到底多高是可以接受的？
由于每個(gè)廠家C18色譜柱都不盡相同，而且有很多不同的參數(shù)會(huì)影響色譜柱的耐水性能，很難有一個(gè)指標(biāo)可以很容易的來(lái)決定到底某一種色譜柱能承受多少的水，所以方法就是直接測(cè)試來(lái)決定到底流動(dòng)相含有多少水是太多。以下是簡(jiǎn)易的實(shí)驗(yàn)：
（1）首先使用高甲醇或是乙腈的溶劑平衡色譜柱，讓顆?？變?nèi)保持“濕潤(rùn)"（wetting）的情況，一般使用20倍柱體積的流動(dòng)相以一般流速?zèng)_洗色譜柱就足夠了；
（2）然后準(zhǔn)備好的含水流動(dòng)相（或是純水）和分析樣品（含兩種或者三種化合物的混合物），需要確保樣品在這種流動(dòng)相條件下可以得到合理的保留時(shí)間，接下來(lái)每一分鐘進(jìn)樣一次一直到色譜柱達(dá)到平衡，保留時(shí)間穩(wěn)定后幾分鐘，然后停泵；
（3）10分鐘后，重新啟動(dòng)泵，再度進(jìn)樣并比較流動(dòng)相停止前與后的保留時(shí)間。如果有明顯的減少，就表示在這個(gè)比例的富水流動(dòng)相有嚴(yán)重的“去濕"（Dewetting），這種色譜柱就必須避免在這個(gè)比例的水（或更高）的流動(dòng)相條件下操作。
圖3是使用兩種不同的C18柱所得到測(cè)試的結(jié)果。種是常規(guī)的C18柱，第二種是帶有親水性的C18柱（AQ-C18）。兩者都是硅膠基質(zhì)的C18柱，但是AQ-C18固定相的設(shè)計(jì)是避免在純水條件下產(chǎn)生“去濕"（Dewetting）的現(xiàn)象，也就說(shuō)AQ-C18可以在純水下操作。在停止流動(dòng)相的前和后的10分鐘內(nèi)每一分鐘進(jìn)樣一次，而中間將流動(dòng)相停止10分鐘。一開(kāi)始時(shí)，保留時(shí)間比較短，主要是色譜柱還沒(méi)有由50/50有機(jī)相/水到99%的水達(dá)到平衡。一旦達(dá)到平衡，可以看到兩種C18色譜柱的保留時(shí)間很相近。但是將流動(dòng)相停止10分鐘后的進(jìn)樣，就看到非常不同的結(jié)果。常規(guī)C18的保留時(shí)間大幅減少（減少75%），而AQ-C18 的保留時(shí)間基本沒(méi)有太大變化。
圖3 停泵10 min前后保留因子的測(cè)定
如果發(fā)現(xiàn)反相柱因?yàn)閮?chǔ)存太久造成保留時(shí)間明顯減少時(shí)，很可能是因?yàn)楣枘z顆粒柱床干涸，也就是已經(jīng)“去濕"（Dewetting）。這種“去濕"并不意味著柱子發(fā)生不可逆的損壞，我們可以嘗試使用有機(jī)相比較高的流動(dòng)相沖洗色譜柱，例如50/50的乙腈/水，以低流速?zèng)_5-10分鐘。一旦流動(dòng)相能重新“濕潤(rùn)"（wetting）顆粒的孔，色譜柱基本就可以恢復(fù)到原來(lái)的保留情況。如果我們?cè)谑褂贸Ｒ?guī)C18柱開(kāi)發(fā)時(shí)，想要確定是否存在由于使用的流動(dòng)相中水的比例太高而使色譜柱“去濕"（Dewetting）的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，可以利用上述的方法測(cè)試含不同比例的水的流動(dòng)相來(lái)快速鑒定 。
為什么有一些C18固定相的反相色譜柱在純水條件下沒(méi)有保留時(shí)間減少的問(wèn)題？
如果想避免這種情況，另一種選擇是使用極性基團(tuán)修飾過(guò)的C18色譜柱，這類(lèi)色譜柱允許在99% 水相的條件下操作。使用帶有極性基團(tuán)的C18色譜柱對(duì)分析極性化合物還有另一重的優(yōu)勢(shì)，那就是這類(lèi)色譜柱除了提供C18的疏水作用外，還有其他的極性作用力，可以增加對(duì)極性化合物的保留。因?yàn)橛辛丝梢栽诩兯畻l件下操作和極性作用力的雙重優(yōu)勢(shì)，帶有極性的C18柱也就越來(lái)越多使用在分析極性化合物。下表是部分可以在純水下操作的反相色譜柱供參考。其他不在表中可在純水下操作的色譜柱，可以咨詢(xún)不同廠家。
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