Cy7酪胺是美國AAT Bioquest生產(chǎn)的Cy系列產(chǎn)品，對于許多免疫組織化學(xué)（IHC）應(yīng)用，傳統(tǒng)的酶促擴(kuò)增程序足以實現(xiàn)足夠的抗原檢測。但是，有幾個因素限制了這些程序的敏感性和實用性。百螢生物是AAT Bioquest的中國代理商，為您提供優(yōu)質(zhì)的Cy7酪胺。

適用儀器

熒光顯微鏡
Ex:	Cy3/TRITC濾波片
Em：	Cy3/TRITC濾波片
推薦孔板:	黑色透明底板
濾波片:	Cy3/TRITC濾波片

實驗方案

樣品染色示例

概述

1.固定/透化/阻斷細(xì)胞或組織
2.在封閉緩沖液中加入一抗
3.加入HRP偶聯(lián)的二抗
4.準(zhǔn)備酪胺工作溶液，在室溫下在細(xì)胞或組織中施用5-10分鐘

操作步驟

在沒有額外說明的情況下，所有未使用的儲備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲存在-20°C，避免反復(fù)凍融循環(huán)。該方案適用于細(xì)胞和組織染色。

1.制備儲存溶液

Tyramide原液（1000X）加入適量的DMSO，制成1-5mM的酪胺儲備液。

注意：未使用的Tyramide原液可以在2-8℃下儲存

2.制備工作溶液

Tyramide工作溶液（1X）：
將1μLTyramide原液加入1 mL含有0.003％H2O2的緩沖液中。
注意：Tris Buffer，pH = 7.4時可用于獲得佳性能。
注意：Tyramide工作溶液應(yīng)立即使用。

3. 細(xì)胞固定和透化

4. 3.1在室溫下用PBS中的3.7％甲醛或多聚甲醛固定細(xì)胞或組織20分鐘。
3.2用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。
3.3在室溫下用0.1％Triton X-100溶液使細(xì)胞透化1-5分鐘。
3.4用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。
注意：組織固定，脫蠟和再水化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)IHC方案對組織進(jìn)行脫蠟和脫水。根據(jù)需要使用優(yōu)選的特定溶液/方案進(jìn)行抗原修復(fù)。

4.過氧化物酶標(biāo)記

4.1任選：通過在過氧化物酶猝滅溶液（例如3％過氧化氫）中孵育細(xì)胞或組織樣品10分鐘來淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性，在室溫下用PBS沖洗兩次。
4.2可選：如果使用HRP偶聯(lián)的鏈霉抗生物S蛋白，建議通過生物S阻斷緩沖液阻斷內(nèi)源性生物S。
4.3用優(yōu)選的封閉溶液（例如含有1％BSA的PBS）在4℃下封閉30分鐘。

4.4取出封閉溶液，加入在推薦抗體稀釋液中稀釋的一抗在室溫下60分鐘或在4°C下過夜。
4.5用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
4.6向每個樣品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室溫下孵育60分鐘。
注意孵育時間和濃度可根據(jù)信號強(qiáng)度而變化。
4.7用PBS洗滌三次，每次5分鐘。

5.酪胺標(biāo)記

5.1為每個樣品準(zhǔn)備并應(yīng)用100μL酪胺工作溶液，并在室溫下孵育5-10分鐘。
注意：如果您觀察到非特異性信號，可以縮短酪胺的孵育時間。您應(yīng)該在不同的孵育時間點使用陽性和陰性對照樣品優(yōu)化孵育期?；蛘吣梢栽诠ぷ魅芤褐惺褂幂^低濃度的酪胺。

5.2用PBS沖洗三次。

6.熒光成像

1.根據(jù)需要對細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行計數(shù)。AAT提供了一系列細(xì)胞核復(fù)染試劑，如表1所列。按照試劑提供的說明進(jìn)行操作。
2.使用具有抗褪色特性的安裝介質(zhì)安裝蓋玻片。
3.使用適當(dāng)?shù)倪^濾器組可視化來自酪胺標(biāo)簽的信號。

表1.推薦用于核復(fù)染的產(chǎn)品

貨號	產(chǎn)品名稱	Ex/Em(nm)
17548	Nuclear Blue DCS1	350/461
17550	Nuclear Green DCS1	503/526
17551	Nuclear Orange DCS1	528/576
17552	Nuclear Red DCS1	642/660

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百螢-Cy3 酪胺產(chǎn)品實驗方案詳情

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